VI Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2014

ВВЕДЕНИЕ

Впервые антипротозойная активность у нитроимидазолов была установлена в 1956 г. у соединения под названием "азомицин", который представлял собой 2-нитроимидазол. В результате дальнейших поисковых исследований было показано, что наиболее высокую антимикробную активность проявляют производные именно 5-нитроимидазола. Причем на первых этапах исследования у этих соединений была установлена только антипротозойная активность. В 1957 г. был синтезирован 5-НИМЗ – метронидазол, который уже в 1960 г. был применен в клинике для лечения трихомонадной инфекции и до сих пор сохраняет высокую эффективность при этом инфекционном заболевании. Подробное изучение биологических и антимикробных свойств метронидазола установило также его высокую активность в отношении облигатных анаэробов. В течение последующих лет велись интенсивные поиски новых соединений в ряду аналогов метронидазола, [13]. В итоге разработан ряд новых высокоэффективных препаратов также с высокой активностью в отношении анаэробных бактерий и некоторых протозоа. Все наиболее активные препараты, применяющиеся в клинической практике, обязательно имеют нитрогруппу в положении 5-го имидазольного цикла, а некоторые различия в их биологических свойствах связаны с модификацией структуры заместителей по положениям 1 и 2-го цикла, [1]. Структура этих заместителей определяет различие в физико-химических свойствах препаратов и, соответственно, особенности их действия. Препараты практически не различаются между собой по спектру и степени активности, ряд отличий связан с фармакокинетическими и некоторыми токсикологическими свойствами (в частности, по взаимодействию с алкоголем) и разработанными лекарственными формами. Все препараты группы 5-НИМЗ – плохо растворимые соединения, что затрудняет разработку инъекционных лекарственных форм. Вместе с тем высокая биодоступность и оптимальное распределение в организме позволяют успешно применять 5-НИМЗ с целью системного действия перорально, [11].

С точки зрения химического строения 5-НИМЗ – это синтетические низкомолекулярные соединения, содержащие нитрогруппу (NO₂) в положении 5-го имидазольного цикла (см. рисунок). По своим биологическим свойствам и механизму антимикробного действия 5-НИМЗ принципиально отличаются от фармакологических препаратов других химических групп и производных имидазола с противогрибковой активностью, [5].

В настоящее время появление на фармацевтическом рынке новых лекарственных форм, содержащих в качестве основного действующего вещества метронидазол, требует совершенствования методов его контроля качества и стандартизации.

Цель настоящей работы заключается в разработке методики определения антибиотиков группы нитроимидазолов (метронидазола) на системе капиллярного электрофореза с УФ-детектированием .

2.ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

2.1. Характеристика нитроимидазолов

Нитроимидазолы - синтетические АМП с высокой активностью в отношении анаэробных бактерий и возбудителей протозойных инфекций. Первый препарат группы - метронидазол - был разрешен для медицинского применения в 1960 г. В последующем были созданы тинидазол, орнидазол, секнидазол и др., в том числе препарат для местного применения тернидазол, [4] (рис.1).

(а)Метронидазол (2-метил-4(5)-нитроимидазол - кристаллическое вещество белого цвета. Мало растворим в воде, метиловом и этиловом спиртах. Умеренно растворим в изопропиловом спирте и дихлорэтане. Тплавл. - 250 - 253 °С.)

.

(б)Тинидазол

(в)Орнидазол

(г)Бензнидазол

Рис.1. Структурные формулы производных нитроимидазола ( а,б,в)

Антибактериальная терапия является одним из важнейших компонентов интенсивной терапии гнойно-септических заболеваний, и ее эффективность оказывает существенное влияние на течение и исход заболевания, [15]. Особый интерес представляет метронидазол (группа нитроимидазолов).

Механизм действия метронидазола заключается в биохимическом восстановлении 5-нитрогруппы метронидазола внутриклеточными транспортными протеинами анаэробных микроорганизмов и простейших. Восстановленная 5-нитрогруппа метронидазола взаимодействует с ДНК клетки микроорганизмов, ингибируя синтез их нуклеиновых кислот, что ведет к гибели микроорганизмов, [8].

Метронидазол — современный высокоактивный препарат, обладающий широким спектром действия в отношении простейших (трихомонад, лямблий, дизентерийных амеб, балантидий, лейшманий), а также споро- и неспорообразующих облигатных анаэробных бактерий, [9].

2 .2. Методы определения метронидазола

Для оценки качества антибиотиков применяют:

• хроматографические методы (ВЭЖХ, ТСХ);

• спектроскопические методы (ИК-спектроскопия, УФ-

• спектроскопия);

• биологические методы;

• химические методы (идентификация с помощью химических

реакций, количественное определение титриметрическими методами и

т.д.).

Важнейшим методом анализа, который используется как для идентификации, так и контроля чистоты и количественного определения антибиотиков является ВЭЖХ. Обычно используется обращённо-фазовый вариант ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектированием.

Для идентификации антибиотиков также используется ТСХ и спектро-

скопические методы (ИК- и УФ-спектроскопия), а для количественного

определения – УФ-спектроскопия, [7].

Количественное определение некоторых антибиотиков, для которых ВЭЖХ-определение затруднено, проводят микробиологическим методом. Примером таких антибиотиков являются аминогликозиды (канамицин, гентамицин и т.д.), [10].Данные вещества не поглощают электромагнитное излучение ближнего УФ-диапазона и поэтому не могут быть непосредственно (т.е. без дополнительного превращения в другие соединения) определены методом ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектированием.

Микробиологический метод количественного определения антибиотиков основан на способности антибиотиков угнетать рост микроорганизмов. Активность исследуемого антибиотика оценивают путём сравнения угнетение роста чувствительных микроорганизмов, вызванного известными концентрациями исследуемого антибиотика и государственного стандартного образца данного антибиотика, [4].

2.3. Обоснование выбора использования капиллярного электрофореза

Использование спектрофотометрического метода для анализа метронидазола затруднено из-за дефицита государственных стандартных образцов на данный препарат. Выпуск таких стандартных образцов является дорогостоящим, так как они находят применение только в фармацевтическом анализе, [7]. Поэтому способ определения с использованием государственных стандартных образцов будет не доступным для многих лабораторий.

Рекомендованный нормативной документацией метод ВЭЖХ для количественного определения метронидазола является дорогостоящим, длительным, трудоемким, требует большого количества различных реактивов, государственных стандартных образцов. Проводить анализ должен специалист, прошедший соответствующую подготовку,[9]

Известен способ ацидиметрического определения метронидазола, заключающийся в приготовлении раствора метронидазола в ледяной уксусной кислоте с последующим титрованием 0,1 М раствором хлорной кислоты до зеленовато-желтой окраски с индикатором кристаллическим фиолетовым (ФС 42-0257-07 «Метронидазол»),но данный метод не являеться абсолютно точным, [9].

На сегодняшний день капиллярный электрофорез является одним из наиболее перспективных методов анализа, он динамично развивается и получает всё более широкое применение в различных областях аналитической химии, [8]. Простота и доступность этого метода, а также неоспоримые преимущества, которые он даёт при выполнении измерений, позволяют надеяться на динамичное развитие методического обеспечения и скорейшее включение капиллярного электрофореза в перечень физико-химических методов анализа, наиболее часто применяемых в повседневной лабораторной практике, [12].

Достоинства капиллярного электрофореза

• Капиллярный электрофорез (КЭФ) обеспечивает очень высокую эффективность разделения (число теоретических тарелок достигает 1.000.000), поэтому метод широко применяется не только для выявления близких по строению веществ (белков, пептидов, аминокислот, витаминов, наркотиков, красителей, ионов металлов, анионов), но и для контроля качества, технологического контроля и идентификации лекарственных препаратов и пищевых продуктов.

• Капиллярный электрофорез (КЭФ) не требует прецизионных насосов высокого давления, необходимых для жидкостной хроматографии, несравнимо меньше расход высокочистых растворителей, объёмы пробы могут составлять всего лишь 100 мкл. Отсутствие твердого сорбента в капилляре исключает возможность его «старения», химической и физической деструкции и любого неспецифического связывания с ним компонентов пробы, [6].

2.4. Принцип капиллярного электрофореза

Разработанный всего несколько десятилетий назад новый метод анализа - капиллярный электрофорез (КЭФ) на сегодняшний день является одним из наиболее перспективных и высокоэффективных методов разделения и анализа компонентов смесей сложного состава на составляющие компоненты, [6].

В состав прибора, реализующего метод капиллярного электрофореза входит в кварцевый капилляр, заполненный электролитом. На поверхности кварцевого капилляра при контакте с водным раствором электролита происходит диссоциация с отщеплением ионов Н⁺. Степень диссоциации зависит от температуры и состава водного раствора, в частности от величины рН.

При прикладывании к капилляру электрического напряжения (~10 ÷ 30 кВ) в капилляре возникнет продольное движение свободных носителей электрических зарядов (разнополярных ионов) во взаимно противоположных направлениях.

При введении в капилляр пробы небольшого объема, компоненты пробы под действием приложенного электрического поля начинают двигаться по капилляру. Скорость движения зависит от структуры, заряда и молекулярной массы компонента. Поэтому различные компоненты достигают детектора, расположенного на другом конце капилляра, в разное время.

Полученная таким образом электрофореграмма представляет собой последовательность пиков, по которым, как и в хроматограмме, можно идентифицировать и количественно определить конкретное соединение, [6].

3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. Оборудование

В работе использовались следующие средства измерения и вспомогательное оборудование:

Аппаратура:

• Система капиллярного электрофореза «Капель 105М» с положительной полярностью источника высокого напряжения (внутренний диаметр капилляра 50 мкм, полная длина капилляра 60 см, эффективная длина 50 см), оснащенная специализированной программой;

• Для записи и обработки полученных данных применяют программное обеспечение «МультиХром».

• Весы лабораторные специального класса точности с ценой деления не более 0,1 мг, наибольшим пределом взвешивания не более 210 г;

• Пробирки одноразовые (типа Эппендорф) вместимостью 1,5 мл;

• Микродозаторы с переменным объемом 10-100 мкл и пределом допускаемой погрешности измерения не более  2 %;

• Центрифуга с числом оборотов 10000 об/мин;

Реактивы:

• Ацетонитрил (CH₃CN)

• Тетраборат натрия (Na_2B4O₇)

• Дистиллированная вода по ГОСТ 6709

• ДДС( додецилсульфата натрия C₁₂H₂₅SO₄Na)

• Раствор метронидазола для инфузий ,0,5мг/мл.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ

3.2. Выбор оптимальных условий

Выбор оптимальных условий будет сводится к подбору ведущего электролита, который будет обеспечивать наилучшее разделение

Для этого , была использована вариация состава ведущего электролита в следующих пропорциях:

1. 10 мМ тетрабората натрия и 20 мМ додецилсульфата натрия

2. 20 мМ тетрабората натрия и 20 мМ додецилсульфата натрия

3. 10 мМ тетрабората натрия и 50 мМ додецилсульфата натрия

4. 10 мМ тетрабората натрия и 50 мМ додецилсульфата натрия 10 % об ацетонитрил

5. 10 мМ тетрабората натрия и 50 мМ додецилсульфата натрия,20 % об ацетонитрил

Полученые электрофореграммы представленнны на рис.1-6:

Рис.1 Электрофореграмма метронидазола в ведущем электролите, состоящего из : 10мМ тетрабората натрия и 20 мМ ДДС.

Рис.2 Электрофореграмма метронидазола в ведущем электролите, состоящего из : 20мМ тетрабората натрия и 20 мМ ДДС

Рис. 3 Электрофореграмма метронидазола в ведущем электролите, состоящего из : 10мМ тетрабората натрия и 50 мМ ДДС

Рис.4 Электрофореграмма метронидазола в ведущем электролите, состоящего из : 10мМ тетрабората натрия ,50 мМ ДДС,10%об ацетонитрил

Рис.5 Электрофореграмма метронидазола в ведущем электролите, состоящего из :10мМ тетрабората натрия , 50 мМ ДДС, 20%об ацетонитрил

Рис.6 Общая электрофореграмма метронидазола в ведущих электролитах.

По результатам, полученным из электрофореграмм, изображенных на рис.1-5 провели расчет эффективности разделения каждого из представленных электролитов по формуле (1) . Результаты занесены в табл. 1

N= 16tмw1/2² (1)

где tм — время миграции аналита

w1/2 — ширина пика на половине высоты.

W1/2 = разница времени начала пика и времени окончания пика

Таблица1

Эффективность разделения ведущих растворов электролита

состав электролита	Эффективность,
110мМ тетрабората натрия и 20 мМ ДДС	6672,68
20мМ тетрабората натрия и 20 мМ ДДС	5646,84
310мМ тетрабората натрия и 50 мМ ДДС	4995,35
410мМ тетрабората натрия ,50 мМ ДДС,10%об ацетонитрил	4439,60
510мМ тетрабората натрия , 50 мМ ДДС, 20%об ацетонитрил	7776,79

Таблица 2

Зависимость состава электролита от площади пика и высоты

Состав электролита(НОМЕР)	Площадь пика, S mAU	Высота пика, h mAU
10мМ тетрабората натрия и 20 мМ ДДС	35,84	0,686
20мМ тетрабората натрия и 20 мМ ДДС	36,77	0,466
10мМ тетрабората натрия и 50 мМ ДДС	39,88	0,639
10мМ тетрабората натрия ,50 мМ ДДС,10%об ацетонитрил	36,96	0,739
10мМ тетрабората натрия , 50 мМ ДДС, 20%об ацетонитрил	46,42	0,601

По данным из табл. 2 строили гистограммы зависимости площади и высоты пика от состава электролита. Рис 7-8.

Рис.7 Гистограмма зависимости площади пика от состава ведущего электролита

Рис.8 Гистограмма зависимости высоты пика от состава ведущего электролита

Исходя из данных приведенных в табл. (1) и гистограмм ( рис7 и рис 8) , установлено, что наилучшее разделение будет при использовании ведущего электролита № 4 (10мМ тетрабората натрия и 50 мМ ДДС,10%об ацетонитрил).

3.3. Построение градуировочнной характеристики

Основным методом градуировки является метод внешнего стандарта (абсо-лютной градуировки). Градуировка может быть одноточечной и многоточечной. Одноточечная означает, что для градуировки компонента используется только один градуировочный раствор, зависимость носит строго линейный характер и, как правило, выходит из начала координат. Это частный случай многоточечной градуировки, для построения которой анализируют несколько специально подобранных по концентрациям градуировочных растворов.

В данной работе применялась одноточечная градуировка.

Приготовление градуировочных растворов:

Для построения градуировки были приготовлены растворы метронидазола концентрации: от 2,5мг/л до10мг/л.

Полученные электрофореграммы, представленны на рис. 9-11 .

Рис 9. Электрофореграмма метронидазол 2,5мг/мл

Рис 10. Электрофореграмма метронидазол 5мг/мл

Рис.11 Электрофореграмма метронидазол 10мг/мл

После выполнения процедуры градуировки программа автоматически рассчитывает градуировочный коэффициент и среднеквадратичное отклонение имеющейся выборки. Градуировку следует считать успешной, если величина СКО не превышает 5%

Полученные с прибора данные занесли в табл. 3

Таблица 3

Высота и площадь пиков метронидазола

Концентрация раствора метронидазола С,мг/мл	Высота пика, h mAU	Площадь пика, S mAU
2,5	0,333	1.45
5	0,606	2.84
5	0,601	2.85
10	1,16	5.65
10	1,17	5.71

СКО=1,034%

По результатам из табл. 3 построили градуировочные графики (рис. 12 и 13) для последующего определения концентрации метронидозола в анализируемом препарате:

Рис 12. График зависимости концентрации С, мг/л от площади пика.

Рис 13. График зависимости концентрации С, мг/л от высоты пика.

На данных графиках наблюдается линейная зависимость, выходящая из начала координат.

3.4. Определение метронидазола в лекарственной форме таблетки

1.Пробоподготовка

На анализ была взята таблетка метронидазола, фирмы « НижФарм»

Навеску (13,8 мг) лекарственного препарата растворяли в 10 мл ацетонитрила, 1 мл которого переносили в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводили объем до метки дистиллированной водой. Затем 1 мл полученного раствора опять переносили в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводили объем до метки дистиллированной водой. После центрифугирования при 6000 об/мин 1 мл полученного раствора использовали для электрофоретического определения при выбранных оптимальных условиях, (табл.4).

Таблица 4

Условия анализа метронидазола

Буфер	10 мМ тетрабоата натрия,50мМ ДДС,20% (об.) ацетонитрила
Проба	Модельный раствор
Капилляр	длиной 0,5 м до детектора, внутренним диаметром 75 * 10-6 м
Ввод пробы	ввод пробы 30 мбар*10с
Напряжения	25кВ
Детектирование	312 нм
температура	20 С0

Далее пробу направили на измерение в прибор. Были получены следующие 3 электрофореграммы, представленные на рис. 14-16 :

Рис.14 Электрофореграмма метронидазола (таблетка)-1

Рис .15 Электрофореграмма метронидазола (таблетка)-2

Рис.16 Электрофореграмма метронидазола (таблетка)-3

По градуировочному графику находят концентрацию определяемых веществ:

С1, мг/л= 13,364

С2, мг/л=13,447

С3, мг/л= 13,429

С использованием полученных данных провели расчет массы метронидазола, содержащегося в образце( таблетки) по формуле (2):

m =C*V1*V2*V3* mтабл mн*V4*V5*V6*103 (2)

где с- полученная концентрация, мг/мл

m_н -масса лекарственного средства ,используемого для анализа;

m_табл- масса таблетки, мг;

V₁- объем ацетонитрла, в котором растворяли навеску;

V₂- объем колбы для разбавления V₄ аликвоты расвора V₁,мл ;

V₃- объем колбы для разбавления V₅ аликвоты расвора V₂,мл;

V₄- аликвота раствора V₁,для разбавления,мл;

V₅- аликвота расвора V₂ для разбавления,мл;

Значения занесены в таблицу 5.

Таблица 5

Результаты определения метронидазола в таблетках

Метронидазол (таблетка)	Концентрация, мг/мл	m (метронидазола), мг в таблетке
С1, мг/л	13,364	284
С2, мг/л	13,447	286
С3, мг/л	13,429	285
среднее		285

Далее произвели расчет метрологических характеристик, таких как дисперсия, стандартное отклонение, относительно стандартное отклонение, доверительный интервал. По следующим формулам, [14] :

Вначале рассчитывают среднее значение массы

₍₃₎

и дисперсию, характеризующую рассеяние результатов относительно среднего.

₍₄₎

Тогда стандартное отклонение аналитического сигнала фона будет равно

₍₅₎

Доверительный интервал рассчитывается по формуле:

m=-+tp,f*Sn (6)

, где n- число измерений;

P- доверительная вероятность

f-число степеней свободы;

по справочнику коэффициент Стьюдента( p и f) :

t (P=0,95; f=2) = 4, 303

Далее рассчитывается предел обнаружения и предел определения:

Предел обнаружения - это минимальная концентрация ,которая фиксируется используемым прибором для получения аналитического сигнала

Предел определения -это минимальное содержание компонента, которое можно определить с заданной степенью точности.

Предел обнаружения С_min = 8.4668*3*h_ср,

Предел определения С_lim= 8.4668*10*h_ср,

Где h_ср- средняя высота пика ;

Полученные результаты занесены в таблицу 6.

Таблица 6

Метрологические характеристики методики определения метронидазола (n=3; Р=0,95)

Метрологические характеристики	значение
дисперсия	0,9
станд. отклонение	0,9
отн. станд. отклонение.	0,003
Доверительный интервал.	2
предел обнаружения Cmin	0.44
предел определения Clim	1.49

В анализируемом препарате оказалось превышение массы действующего вещества (содержание метронидазола 285 ± 2 мг/л)

ВЫВОДЫ

1. Установлена возможность определения метронидазола методом капиллярного электрофореза.

2. Выбраны оптимальные условия определения метронидазола методом КЭ: напряжение +25 кВ, длина волны 312нм, температура 20 °С, ввод пробы 30 мбар*10с, ведущий электролит 10мМтетрабоата натрия,50мМ ДДС,10% (об.) ацетонитрила, капилляр длиной 0,5 м до детектора, внутренним диаметром 75 * 10^-6 м

3. Изучено влияние состава электролита на эффективность разделения метнонидазола(10мМтетрабоата натрия,50мМ ДДС,20% (об.) ацетонитрила)

4. Определены метрологические характеристики методики определения метронидазола : предел обнаружения метронидазола 0,44 мг/л;

5. Разработана методика определения метронидазола. Методика характеризуется хорошей воспроизводимостью результатов

Код для цитирования: Скопировать