VI Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2014

1.Введение

В конце ХХ столетия среди основных химиотерапетических средств для лечения инфекций одно из важных мест заняли фторхинолоны – большая группа высокоэффективных антимикробных препаратов с широкими показаниями к применению. Термин “фторхинолоны” (наиболее точно – “6-фторхинолоны”) характеризует принадлежность препаратов к классу хинолонов (или родственным по структуре соединениям) с наличием атома фтора в молекуле, причем в строго определенном положении 6 хинолонового цикла. Все препараты класса хинолонов, независимо от наличия или отсутствия фтора в молекуле, объединены единым механизмом действия на микробную клетку: их основной мишенью является ДНК-гираза – один из ключевых ферментов клетки, определяющий нормальный процесс биосинтеза ДНК и деления клетки. Поэтому данный класс веществ часто обозначают общим термином “Ингибиторы ДНК-гиразы”. Нефторированные хинолоны, среди которых первым препаратом была налидиксовая кислота (неграм), синтезированная в 1962 г., имеют ограниченный спектр действия с преимущественной активностью в отношении некоторых грамотрицательных бактерий, главным образом из группы энтеробактерий. Особенности фармакокинетики нефторированных хинолонов позволяют применять эти препараты при чувствительном возбудителе только для лечения инфекций мочевыводящих путей и некоторых кишечных инфекций. Достаточно быстрое развитие лекарственной резистентности к нефторированным хинолонам у клинических штаммов бактерий существенно ограничивает их применение в клинике, хотя некоторые препараты этой группы до сих пор представлены на фармацевтическом рынке (например, налидиксовая кислота, оксолиниевая кислота, пипемидиевая кислота).

Несмотря на обилие информации о фармакологических свойствах и клиническом применении фторхинолонов, в доступной литературе имеется недостаточное количество данных о физико-химических, в том числе

спектральных, характеристиках фторхинолонов. В связи с высокой востребованностью группы препаратов необходима разработка современных, простых в исполнении методик анализа. Целью данной дипломнойработы является разработка оптимальной методики определения фторхинолонов методом капиллярного электрофореза. Возрастание количества публикаций в отечественной литературе отражает актуальность и значимость разработки методик, основанных на этом методе, в аналитической практике.

2.Обзор литературы

2.1.Характеристика фторхинолонов

Фторхинолоны(англ. fluoroquinolones) - группа лекарственных веществ, обладающих выраженной противомикробной активностью, широко применяющихся в медицине в качестве антибиотиков широкого спектра действия. По широте спектра противомикробного действия, активности, и показаниям к применению они действительно близки к антибиотикам, но отличаются от них по химической структуре и происхождению. (Антибиотики являются продуктами природного происхождения либо близкими синтетическими аналогами таковых, в то время, как фторхинолоны не имеют природного аналога). Общепринятой систематизации фторхинолонов нет. Существует несколько классификаций: фторхинолоны разделяют по поколениям; по количеству атомов фтора в молекуле (монофторхинолоны, дифторхинолоны и трифторхинолоны); а также на фторированные и антипневмококковые (или респираторные)[14].

Фторхинолоны по поколениям подразделяют на препараты первого (пефлоксацин, офлоксацин,ципрофлоксацин, ломефлоксацин, норфлоксацин, второго поколения (левофлоксацин, спарфлоксацин)[1],третьего и четвертого поколения(моксифлоксацин, гемифлоксацин, гатифлоксацин, ситафлоксацин, тровафлоксацин).[2] Из препаратов группы фторхинолонов ломефлоксацин,

офлоксацин, ципрофлоксацин, левофлоксацин, спарфлоксацин и моксифло-ксацин входят в перечень жизненно необходимых и важнейших лекарственных препаратов. Структура фторхинолонов представлена на рис.1.

Рис.1. Структура фторхинолонов

Фторхинолоны существенно отличаются от нефторированных препаратов класса хинолонов представлена в табл. 1 [3] .

Таблица 1

Основные характеристики биологического действия препаратов класса хинолонов

Фторхинолоны

Нефторированные хинолоны

Широкий антимикробный спектр действия: грамположительные и грамотрицательные аэробные и анаэробные бактерии, микобактерии, микоплазмы, хламидии, риккетсии, боррелии

Ограниченный спектр действия, преимущественная активность в отношении Enterobacteriaceae

Выраженный постантибиотический эффект

Постантибиотический эффект слабо выражен или отсутствует

Высокая степень биодоступности

Биодоступность невысокая

Оптимальные фармакокинетические свойства, хорошее проникновение в органы, ткани, биологические жидкости (для некоторых препаратов - через ГЭБ)

Низкие концентрации в сыворотке крови, плохое проникновение в органы, ткани и клетки; высокие концентрации в моче

Широкие показания к применению: бактериальные инфекции различной локализации, хламидиозы, микобактериозы (для некоторых препаратов в комплексной терапии), риккетсиозы, боррелиоз. Системное действие при генерализованных формах инфекций

Ограниченные показания к применению: главным образом инфекции мочевыводящих путей, некоторые кишечные инфекции (дизентерия, энтероколиты)

Применение внутрь и парентерально

Применение только внутрь

Относительно низкая токсичность

Относительно низкая токсичность

Артротоксичность в эксперименте для неполовозрелых животных в определенные возрастные периоды

Артротоксичность в эксперименте для неполовозрелых животных в определенные возрастные периоды

Хорошая переносимость больными

Хорошая переносимость больными

Применение у взрослых больных; ограничения к применению в педиатрии (в период роста и формирования костно-суставной системы) на основании экспериментальных данных

Применение у взрослых больных и в педиатрии (несмотря на данные по артротоксичности в эксперименте)

Эти различия позволяют с полным основанием рассматривать фторхинолоны как самостоятельную группу высокоактивных препаратов в пределах класса хинолонов, что подтверждается многочисленными экспериментальными данными и большим клиническим опытом, накопленным за 15 лет: число больных, которым с успехом были применены фторхинолоны, в настоящее время исчисляется десятками миллионов. Накопленный большой опыт по применению фторхинолонов в широкой клинической практике позволяет выделить в настоящее время наиболее важные и широко применяющиеся препараты этой группы[8]. К ним относятся монофторхинолоны - ципрофлоксацин, офлоксацин, пефлоксацин и норфлоксацин и дифторхинолон ломефлоксацин; они зарегистрированы и разрешены для применения в России [9].

Наиболее важными свойствами с точки зрения антимикробной активности являются:

– широкий антимикробный спектр с преимущественной высокой активностью в отношении аэробных грамотрицательных и грамположитель-ных бактерий;

– активность в отношении микроорганизмов с внутриклеточной локализацией, включая легионеллы, хламидии, микоплазмы, микобактерии;

– активность в отношении штаммов бактерий, устойчивых к препаратам других классов химиотерапевтических средств, а также в отношении большинства штаммов, устойчивых к нефторированным хинолонам;

– бактерицидный тип действия, причем бактерицидные концентрации равны или, как правило, существенно не превышают бактериостатические;

– глубокие повреждения структуры и функции микробной клетки даже при действии субингибирующих концентраций, подавление индукции клеткой экзоферментов, экзотоксинов, снижение вирулентных свойств штаммов, что существенно повышает фагоцитарную активность в отношении поврежденных клеток;

– длительный постантибиотический эффект, особенно после воздействия бактерицидных концентраций.

Применяемые в клинической практике фторхинолоны не активны в отношении вирусов, грибов, возбудителя сифилиса и не применяются для лечения этих заболеваний.

По механизму действия на микробную клетку фторхинолоны принципиально отличаются от антимикробных препаратов других классов химических веществ. Мишенью их действия в микробной клетке являются два жизненно важных фермента из группы топоизомераз, отвечающие за процесс нормального деления клетки. В первую очередь, это топоизомераза II бактерий или ДНК-гираза (гираза – от giration – вращение, скручивание). Фермент катализирует процесс суперскручивания или суперспирализации нитей ДНК, что необходимо для оптимальной укладки (топологии) ДНК в клетке. Второй фермент – топоизомераза IV, регулирует уровень суперспирализации. В настоящее время показано, что при действии на грамотрицательные бактерии в первую очередь мишенью является ДНК-гираза, а при действии на грамположительные – топоизомераза IV. Ингибирование функции указанных ферментов приводит к необратимым изменениям в клетке и в итоге к ее гибели, т.е. к бактерицидному эффекту. Специфичность мишени обеспечивает активность фторхинолонов в отношении большинства штаммов бактерий, устойчивых к действию антимикробных препаратов других фармакологических групп.

Следует отметить, что высокая бактерицидная активность фторхинолонов позволяет в отношении ряда штаммов преодолевать уровень устойчивости, возникший к нефторированным хинолоном.

2.2.Ципрофлоксацин

В данной дипломной работе была разработана методика определения ципрофлоксоцина, антибактериального препарата из группы фторхинолонов II поколения. Структурная формула представлена на рис.2.

Рис.2. Структурная формула ципрофлоксацина

Ципрофлоксацин - один из наиболее эффективных фторхинолонов, он нашёл широкое применение в клинической практике, что отразилось, в частности, в большом количестве наименований, под которыми он выпускается в разных странах.[4]

Противомикробное средство широкого спектра действия, производное фторхинолона, подавляет бактериальную ДНК-гиразу(топоизомеразы II и IV, ответственные за процесс суперспирализации хромосомной ДНК вокруг ядерной РНК, что необходимо для считывания генетической информации), нарушает синтез ДНК, рост и деление бактерий; вызывает выраженные морфологические изменения (в том числе клеточной стенки и мембран) и быструю гибель бактериальной клетки.

2.3.Методы определения фторхинолонов

2.3.1.Высокоэффективная жидкостная хроматография

Разработан быстрый, точный и чувствительный метод для количественного определения 4 фторхинолонов высокой активности против широкого спектра грамотрицательных и грамположительных организмов (эноксацина, норфлоксцина, офлоксацина и ципрофлоксацина).

Использована аналитическая колонка длиной в 5 мкм, с системой элюирования с концентрацией 0.4 моль*л^-1состоящей из CH₃CN- CH₃OH -лимонная кислота (объемное соотношение 7:15:78%).Обнаружение проводили с переменной длиной волны с детектором видимых ультрафиолетовых лучей при 275 нм в результате чего предел обнаружения: 0,02 нг на 20 мкл для инъекций эноксацина и 0,01 нг для офлоксацин, норфлоксацин и ципрофлоксацин. В качестве внутреннего стандарта использовали гидрохлоротиазид с концентрацией 2 нг*мкл^-1

Прямолинейное отношение наблюдалось до 2 нг* мкл^-1 эноксацина, 12 нг *мкл^-1 офлоксацин, 3нг*мкл^-1 норфлоксацина и 5 нг мкл^-1 для ципрофлоксацина.

Разделение было достигнуто в течение 10 мин. Статистическая оценка метода исследования проводилась путем выполнения определения в течение дня(n=8) и через день(n=8) и было установлено, что результаты удовлетворительны и с высокой точностью.

Метод был применен для прямого определения четырех фторхинолонов в сыворотке крови человека. Восстановление аналитов в образцах составило 97 ± 6% в диапазоне 0,1-0,5 нг*мкл^-1.

Выделение и анализ фторхинолонов в субстанциях лекарственных формах и биожидкостях с использованием хроматографии и спектрофотометрии.

Используя метод УФ-спектрофотометрии, получены методики качественного и количественного определения фторхинолонов в субстанциях, лекарствен-ных формах и биожидкостях. В качестве метода экспресс-очистки биоматериала использована гель-хроматография со сменой элюэнта.

Метод ВЭЖХ позволяет получить надежные результаты, но стоимость оборудования и стандартных образцов, токсичность используемых растворителей, а также потребность в высококвалифицированных специалистах ограничивают его применение для массовых анализов.

Для количественного определения препаратов перспективно применение метода спектрофотометрии. Отсутствие необходимости стандартизации титранта, сокращение времени на подготовительные операции, экспрессность и высокие метрологические характеристики дают методу явные преимущества,[5].

Показано, что при анализе лекарственных средств группы фторхинолонов методом ВЭЖХ использование буферных растворов в составе подвижной фазы и добавление ион-парных реагентов существенно повышает эффективность колонки и симметричность пиков анализируемых соединений. Установлено, что в условиях обращено-фазовой ВЭЖХ оптимальные значения параметров хроматографических пиков фторхинолонов наблюдаются в подвижной фазе, содержащей в качестве водного компонента фосфатный буфер с рН 2,5 с добавлением тетрабутиламмония в концентрации 1 ммоль/л,[6].

2.3.2.Капиллярный электрофорез

В последние два десятилетия в мире отмечен активный интерес к новому, интенсивно развивающемуся методу разделения сложных смесей- капиллярному электрофорезу, позволяющему анализировать ионные и нейтральные компоненты различной природы с высокой экспрессностью и уникальной эффективностью.

В основе капиллярного электрофореза лежат электрокинетические явления - электромиграция ионов и других заряженных частиц и электроосмос. Эти явления возникают в растворах при помещении их в электрическое поле, преимущественно, высокого напряжения. Если раствор находится в тонком капилляре, например, в кварцевом, то электрическое поле, наложенное вдоль капилляра, вызывает в нем движение заряженных частиц и пассивный поток жидкости, в результате чего проба разделяется на индивидуальные компоненты, так как параметры электромиграции специфичны для каждого сорта заряженных частиц. В то же время, такие возмущающие факторы, как диффузионные, сорбционные, конвекционные, гравитационные и т. п., в капилляре существенно ослаблены, благодаря чему достигаются рекордные эффективности разделений [10].

Традиционно капиллярный электрофорез сравнивают с высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ), поскольку в обоих методах разделение происходит в ограниченном пространстве (капилляре или колонке) с участием движущейся жидкой фазы (буферного раствора или подвижной фазы (элюента)) и для регистрации сигналов используют схожие принципы детектирования и программы обработки данных. Тем не менее у методов есть отличия, которые, безусловно, относятся к достоинствам капиллярного электрофореза [12]:

• высокая эффективность разделения (сотни тысяч теоретических тарелок), недоступная ВЭЖХ и связанная с плоским профилем ЭОП,

• малый объем анализируемой пробы и буферов (не более 1–2 мл в день), при этом практически не требуется применение высокочистых, дорогостоящих органических растворителей,

• отсутствие колонки, сорбента, проблем с его старением и, значит, заменой колонки,простая и недорогая аппаратура,

• экспрессность и низкая себестоимость единичного анализа.

Из ограничений КЭ следует отметить невысокую, по сравнению с ВЭЖХ, концентрационную чувствительность и требование к анализируемым соединениям растворяться в воде и разбавленных водно-органических смесях [13]. В то же время эти ограничения не являются непреодолимыми. Так, недостаточную чувствительность определения при использовании УФ-детектирования (из-за малой длины оптического пути, равного внутреннему диаметру капилляра) может скомпенсировать использование таких видов детектирования, как лазерно-индуцированное флуориметрическое или масс-спектрометрическое в сочетании с различными приемами on-line концентрирования пробы (т. н. стэкинг и свиппинг). А вариант неводного капиллярного электрофореза успешно позволяет разделять и анализировать сильно гидрофобные,нерастворимые в водных растворах компоненты пробы,[7].

Метод КЭ применяется для исследования 10 хинолонов первого и второго поколений- налидиксовой кислоты, оксолиновой кислоты, пипемидовой кислота, циноксацин, норфлоксацин, ципрофлоксацин, офлоксацин, пефлоксацин, флероксацин, и флумекин. Разделение проводится с использованием кварцевого капилляра ( внутренний диаметр 75 мкм) и фосфатного буфера (рН 7,0, конц. 125 мМ). Определение проводится при длине волны 214 нм. При данных условиях не разделяются только норфлоксацин и ципрофлоксацин. Из-за специфичности метода стала возможна идентификация отдельных хинолонов с помощью их времени миграции. Такого вида система применяется для определения хинолонов в таблетках и капсулах. Вспомогательные вещества не оказывают отрицательного воздействия на результаты анализа. Также возможно одновременное качественное и количественное определение активного вещества в готовом продукте,[15].

3. Экспериментальная часть

3.1. Реагенты и аппаратура

В работе использовали следующие реагенты:

1. Стандартный раствор ломефлоксацина 20 мг/л

2. Стандартный раствор данофлоксацина 20 мг/л

3. Стандартный раствор эноксацина 20 мг/л

4. Стандартный раствор ципрофлоксацина 20 мг/л

5. Стандартный раствор левофлоксацина 20 мг/л

6. Стандартный раствор энрофлоксацина 20 мг/л

7. Стандартный раствор пефлоксацина 20 мг/л

8. Фосфатный буферный раствор

9. Дистиллированная вода по ГОСТ 6709

В работе использовались следующие средства измерения и вспомогательное оборудование:

1. Система капиллярного электрофореза «Капель 105М» с положительной полярностью источника высокого напряжения (внутренний диаметр капилляра 50 мкм, полная длина капилляра 60 см, эффективная длина 50 см), оснащенная специализированной программой;

2. Пробирки одноразовые (типа Эппендорф) вместимостью 1,5 мл;

3. Весы лабораторные специального класса точности с ценой деления не более 0,1 мг, наибольшим пределом взвешивания не более 210 г;

4. Центрифуга с числом оборотов 10000 об/мин;

5. Микродозаторы с переменным объемом 10-100 мкл, 100 –1000 мкл, 1000-5000 мкл и пределом допускаемой погрешности измерения не более  2 %;

3.2.Определение ципрофлоксацина

Пробоподготовка: навеску ципрофлоксацина (14,7 мг) растворили в смеси 0,5 мл 1М HCl и 9,5 мл дистиллированной воды. Полученный раствор фильтровали через мембранный фильтр (размер пор 0,45 мкм) и разбавили в 50 раз (20 мкл раствора + 980 мкл воды). Провели электрофоретичекое разделение.

Условия проведения анализа: Измерение проводят на системе капиллярного электрофореза «Капель-105М». Для определения используют капилляр внутренним диаметром 50 мкм. Ведущий электролит - 20 мМ фосфатного буфера. Температура-35 °С. Ввод пробы 30 мбар × 10 с. При длине волны 280 нм.

4. Результаты и их обсуждение

4.1Выбор оптимальных условий электрофоретического разделения

Электрофореграммы смеси фторхинолонов при различных значениях рН фосфатного буферного раствора приведены на рис.3-6.

Рис.3. Электрофореграмма смеси фторхинолонов; внутренний диаметр капилляра 50 мкм, ведущий электролит 20 мМ ФБ рН = 7,0, 35 °С, ввод пробы 30 мбар × 10 с, длина волны 280 нм; 1-ломефлоксацин,2-данофлоксацин,3-эноксацин,4-ципрофлоксацин

Рис.4. Электрофореграмма смеси фторхинолонов; внутренний диаметр капилляра 50 мкм, ведущий электролит 20 мМ ФБ рН = 7,5, 35 °С, ввод пробы 30 мбар × 10 с, длина волны 280 нм; 1-ломефлоксацин,2-данофлоксацин,3-эноксацин,4-ципрофлоксацин,5-левофлоксацин,6-энрофлоксацин,7-пефлоксацин

Рис.5. Электрофореграмма смеси фторхинолонов; внутренний диаметр капилляра 50 мкм, ведущий электролит 20 мМ ФБ рН = 8,0, 35 °С, ввод пробы 30 мбар × 10 с, длина волны 280 нм; 1-ломефлоксацин,2-данофлоксацин,3-эноксацин,4-ципрофлоксацин,5-левофлоксацин,6-энрофлоксацин,7-пефлоксацин

Рис.6. Электрофореграмма смеси фторхинолонов; внутренний диаметр капилляра 50 мкм, ведущий электролит 20 мМ ФБ рН = 8,5, 35 °С, ввод пробы 30 мбар × 10 с, длина волны 280 нм1-ломефлоксацин,2-данофлоксацин,3-эноксацин,4-ципрофлоксацин,5-левофлоксацин,6-энрофлоксацин,7-пефлоксацин

Метод капиллярного электрофореза характеризуется высокой эффективностью. Эффективность N, выраженная числом теоретических тарелок, может быть определена непосредственно из электрофореграммы по уравнению:

N=16(tmV)² ;

где tm-время удерживания, мин; V- площадь пика

Результаты расчета эффективности разделения 7 фторхинолонов приведены в табл. 2.

Таблица 2

Эффективность разделения фторхинолонов

при различных значениях pH

Фторхинолоны	Эффективность
	pH =7.0	pH =7.5	pH =8.0	pH =8.5
Ломефлоксацин	840,20	344,28	376,02	440,93
Данофлоксацин	13,84	481,09	416,16	328,75
Эноксацин	325,80	729,53	696,70	516,47
Ципрофлоксацин	1321,00	1005,75	52,10	44,52
Левофлоксацин	-	102,09	46,49	37,90
Энрофлоксацин	-	24,41	229,23	198,23
Пефлоксацин	-	258,03	493,32	465,20
Время разделения, мин	7,5	8,5	8,5	8,5

Из таблицы следует, что значение эффективности разделения смеси фторхинолонов при pH =8,5- наилучшее

Важной задачей любого сепарационного метода является селективность разделения компонентов пробы. Повышение селективности разделения в КЭФ может быть обеспечено за счёт изменения рН ведущего электролита.[11] Селективность α определяется отношением приведенных времен удерживания двух пиков по следующему уравнению:

где tr – время миграции компонента, мин.

Значения величины селективности пиков представлены в табл. 3.

Таблица 3

Селективность пиков фторхинолонов при различных значениях pH

Пары пиков фторхинолонов	Селективность
	pH =7.0	pH =7.5	pH =8.0	pH =8.5
1-2	0,97	0,22	0,95	0,94
2-3	0,96	0,97	0,98	0,98
3-4	0,93	0,98	0,98	0,98
4-5	-	0,99	0,97	0,98
5-6	-	0,99	0,95	0,96
6-7	-	0,94	0,96	0,96

1-ломефлоксацин,2-данофлоксацин,3-эноксацин,4-ципрофлоксацин,5-левофлоксацин,6- энрофлоксацин,7-пефлоксацин

Из таблицы следует, что значение селективности при pH =8,5- наилучшее.

Обобщающим параметром, характеризующим степень разделения веществ с учетом как селективности, так и эффективности процесса, служит фактор разрешения (сокращенно называемый просто «разрешением») Rs- Для пиков двух веществ А и В. Рассчитывается по формуле:

где tr_i-время миграции компонентов, мин; w_i- ширина основания пика компонента, мин.

Значения величины разрешения пиков представлены в табл.4.

Таблица 4

Разрешение пиков фторхинолонов при различных значениях pH

Пары пиков фторхинолонов	Разрешение
	pH =7.5	pH =8.0	pH =8.5
1-2	-	4,12	5,60
2-3	1,65	1,18	1,20
3-4	1,42	1,47	1,36
4-5	1,33	1,42	1,39
5-6	0,33	4,44	2,70
6-7	3,55	4,47	3,52

1-ломефлоксацин,2-данофлоксацин,3-эноксацин,4-ципрофлоксацин,5 -левофлоксацин,6- энрофлоксацин,7-пефлоксацин

Таким образом, разделение смеси фторхинолонов будет наиболее эффективным при рН = 8,5 чувствительность метода, а также селективность и разрешение пиков будут наилучшими.

4.2.Построение градуировочных графиков

В работе были получены электрофореграммы стандартных растворов семи фторхинолонов концентрациями 2,5; 5; 10; 20 мг/л.

1-ломефлоксацин,2-данофлоксацин,3-эноксацин,4-ципрофлоксацин,5-левофлоксацин,6- энрофлоксацин,7-пефлоксацин

Рис.7. Электрофореграмма стандартного раствора, С=2,5мг/л, капилляр 50 мкм, ведущий электролит 25 мМ ФБ рН = 8,5, 35 °С, ввод пробы 30 мбар × 10 с, длина волны 280 нм; 1-ломефлоксацин,2-данофлоксацин,3-эноксацин,4-ципрофлоксацин,5-левофлоксацин,6-энрофлоксацин,7-пефлоксацин

Рис. 8. Электрофореграмма стандартного раствора, С=5 мг/л, капилляр 50 мкм, ведущий электролит 25 мМ ФБ рН = 8,5, 35 °С, ввод пробы 30 мбар × 10 с, длина волны 280 нм; 1-ломефлоксацин,2-данофлоксацин,3-эноксацин,4-ципрофлоксацин,5-левофлоксацин,6-энрофлоксацин,7-пефлоксацин

Рис.9. Электрофореграмма стандартного раствора, С=10 мг/л, капилляр 50 мкм, ведущий электролит 25 мМ ФБ рН = 8,5, 35 °С, ввод пробы 30 мбар × 10 с, длина волны 280 нм; 1-ломефлоксацин,2-данофлоксацин,3-эноксацин,4-ципрофлоксацин,5-левофлоксацин,6-энрофлоксацин,7-пефлоксацин

Рис .10. Электрофореграмма стандартного раствора, С=20мг/л, капилляр 50 мкм, ведущий электролит 25 мМ ФБ рН = 8,5, 35 °С, ввод пробы 30 мбар × 10 с, длина волны 280 нм; 1-ломефлоксацин,2-данофлоксацин,3-эноксацин,4-ципрофлоксацин,5-левофлоксацин,6-энрофлоксацин,7-пефлоксацин

Результатом градуировки системы является формирование таблицы компонентов - табл.5 (содержит времена миграции и имена определяемых компонентов).

Таблица 5

Концентрации стандартных растворов фторхинолонов

Антибиотики	Навеска, мг	Чистота, %	Объем Ст. раствора	С1 мг/л	С2 мг/л	С3 мг/л	С4 мг/л
Ломефлоксацин	6,9	100	10	13,80	6,90	3,45	1,73
Данофлоксацин	4,8	94	5	18,05	9,02	4,51	2,26
Эноксацин	9	100	10	18,00	9,00	4,50	2,25
Ципрофлоксацин	7,9	100	10	15,80	7,90	3,95	1,98
Левофлоксацин	11,8	98	10	23,13	11,56	5,78	2,89
Энрофлоксацин	10,2	100	10	20,40	10,20	5,10	2,55
Пефлоксацин	8,5	99	10	16,83	8,42	4,21	2,10

Результатом градуировки системы является также построение градуировочной зависимости, которая показывает зависимость площади пика от концентрации/содержания вещества и представлена на рис. 10-16.

Рис.10. Градуировочная характеристика компонента ломефлоксацин (Q=5,44102, СКО=3,486 %, Корр=0,99896)

Рис.11. Градуировочная характеристика компонента - данофлоксацин(Q=5,6788, СКО=4,520 %, Корр=0,99886)

Рис.12. Градуировочная характеристика компонента – эноксацин (Q=8,07753, СКО=0,709 %, Корр=0,99996)

Рис.13. Градуировочная характеристика компонента – ципрофлоксацин (Q=5,25716, СКО=2,400 %, Корр=0,99997)

Рис.14. Градуировочная характеристика компонента – левофлоксацин (Q=5,26613, СКО=1,874 %, Корр=0,99994)

Рис.15. Градуировочная характеристика компонента – энрофлоксацин (Q=6,34641, СКО=4,313 %, Корр=0,99956)

Рис.16. Градуировочная характеристика компонента – пефлоксацин (Q=6,06611, СКО=6,455 %, Корр=0,99828)

4.3.Анализ ципрофлоксацина

Определив оптимальные условия электрофоретического разделения (а именно подобрав нужное значение pH ведущего электролита) проводим анализ препарата (таблетки) «Ципрофлоксацин 250 мг»(Рис.17-19)

Рис. 17. Электрофореграмма препарата «Ципрофлоксацин» с концентрацией С₁

Рис.18. Электрофореграмма препарата «Ципрофлоксацин» с концентрацией С₂

Рис.19. Электрофореграмма препарата «Ципрофлоксацин» с концентрацией С₃

По градуировочному графику находим концентрацию определяемого вещества. Отсюда С₁=18,05мг/л,С₂=18,77мг/л, С₃=18,77мг/л.

Используя полученные данные, проводим расчет массы ципрофлоксацина, содержащегося в образце (таблетке) по формуле:

m =C*V1*V2*V3* mтаблmн*V4*V5*V6*103

где С- полученная концентрация, мг/мл; m_н -масса лекарственного средства ,используемого для анализа; m_табл- масса таблетки, мг; V₁- объем ацетонитрла, в котором растворяли навеску; V₂- объем колбы для разбавления V₄ аликвоты раствора V₁,мл ; V₃- объем колбы для разбавления V₅ аликвоты раствора V₂,мл; V₄- аликвота раствора V₁,для разбавления, мл; V₅- аликвота раствора; V₂ для разбавления, мл;

m₁= 235 мг

m₂=245мг

m₃= 245мг

m _{среднее} = 241мг

Далее рассчитываем метрологические характеристики, такие как дисперсия, стандартное отклонение, относительно стандартное отклонение, доверительный интервал. По следующим формулам:

Вначале рассчитывают среднее значение массовой доли:

и дисперсию, характеризующую рассеяние результатов относительно среднего:

Тогда стандартное отклонение аналитического сигнала фона будет равно:

Доверительный интервал рассчитывается по формуле:

m=-+tp,f*Sn ;

где n- число измерений;P- доверительная вероятность f-число степеней свободы;по справочнику коэффициент Стьюдента( p и f) :t (P=0,95; f=2) = 4, 303

В анализируемом препарате содержание ципрофлоксацина 241±0, 3 мг

4.4.Предел обнаружения.

Диапазон определяемых содержаний

Определение предела обнаружения:

Предел обнаружения и нижняя граница определяемых содержаний – это, прежде всего, характеристики чувствительности метода или методики.

Предел обнаружения С_min – наименьшее содержание, при котором по данной методике можно обнаружить присутствие компонента с заданной доверительной вероятностью. Таким образом, понятие предела обнаружения относится к области качественного анализа, и определяет минимальное количество m_min (или концентрацию c_min) компонента, которое может быть обнаружено с достаточно высокой (Р = 0,95 или Р = 0,99) заданной вероятностью. Предел обнаружений может быть задан и минимальным аналитическим сигналом y_min, который можно уверенно отличать от сигнала контрольного опыта – у_фон. Минимальный аналитический сигнал должен быть выбран таким образом, чтобы не допустить ошибки «переоткрытия или недооткрытия» компонента.

C_min=k*3*h_ср (мг/л)

Где S/N=3

Диапазон определяемых содержаний может задаваться граничными значениями аналитического сигнала. Наименьшее (наибольшее) значение определяемого содержания, ограничивающее диапазон определяемых содержаний. Нижняя граница диапазона определяемых содержаний - наименьшее значение определяемого содержания, ограничивающее область значений определяемых содержаний снизу, называется нижней границей или нижним пределом определяемых содержаний. В практике анализа чистых веществ за нижнюю границу принимают то минимальное содержание, которое можно определить данным методом с относительным стандартным отклонением 0,33. Нижний предел вычисляется как утроенное стандартное отклонение результата определения при концентрации, близкой к предельной.

5. Выводы

1. Установлена возможность анализа фторхинолонов методом зонного капиллярного электрофореза; изучена возможность применения капиллярного электрофореза для количественного определения фторхинолонов (ципрофлоксацина) в лекарственном препарате;

2. Выбраны оптимальные условия определения ципрофлоксацина методом ЗКЭ: напряжение +25 кВ, длина волны 280 нм, температура 35 °С, ввод пробы 30 мбар*10с, ведущий электролит 20мМ фосфатного буфера, давление 5 мбар, капилляр внутренним диаметром 60 мкм;

3. Изучено влияние pH ведущего электролита на эффективность разделения смеси фторхинолонов. Установлено, что при pH=8.5 разделение смеси фторхинолонов наиболее эффективно.

4.Определены метрологические характеристики методики определения ципрофлоксацина: предел обнаружения 1,25 мг/л;

5.Разработана методика определения ципрофлоксацина. Методика характеризуется хорошей воспроизводимостью результатов (s_r

Код для цитирования: Скопировать