V Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2013

Колорадский жук Leptinotarsa decemlineata Say – вид с продолжающимися процессами видообразования, характеризуется значительным внутривидовым полиморфизмом и экологической пластичностью [1, 2]. Это позволяет ему успешно адаптироваться, в том числе и к антропогенным воздействиям – у колорадского жука развилась резистентность к почти всем используемым на настоящий момент и применявшимся ранее инсектицидам, во всём его ареале. Согласно современному взгляду на популяцию как на единицу эволюции и одновременно – единицу управления видами [3], очевидна необходимость изучения этого вида на популяционном уровне.

Изменения структуры популяций колорадского жука, происходящие с высокой скоростью, обуславливают необходимость систематического анализа с использованием большого количества типов фенов. Разработанные в последние десятилетия молекулярно-биологические методы генетического анализа позволяют оценить степень внутривидового полиморфизма на уровне первичной структуры ДНК [4, 5]. Сочетание классических и современных методов должно дать наиболее адекватную оценку уровня полиморфизма и популяционной структуры вида. Целью работы является изучение особенностей формирования популяционной структуры колорадского жука на территории вторичного (евразийского) ареала.

методика

Имаго колорадского жука были собраны в 9 локальных популяциях с территории России, Украины и Казахстана. Название популяций, даты сбора и географические координаты рассматриваемых популяций приведены в табл. 1. До начала использования образцы хранились в пластиковых баночках в 96% этаноле в холодильнике.

Анализ фенетического полиморфизма. Для анализа фенетического полиморфизма использовались фены рисунка темени, 5 вариаций [6 – 8], затылка, 3 вариации [7, 8], пронотума, 9 вариаций [9] и элитр, 5 вариаций [6 – 8].

Оценку внутрипопуляционного разнообразия проводили с использованием среднего числа вариаций  [10]. Расчеты проводили с использованием компьютерной программы Microsoft Excel 2002, (1985-2001, Microsoft Corporation). Изолинии, отображающие распределение рассматриваемых показателей в популяциях, строили при помощи компьютерной программы 3D Field 3.0.8.0 (1998 – 2008, Vladimir Galouchko). Анализ частот RR, SR и RR генотипов AChE и LdVssc1 проводился с помощью программы Genepop 4.0 [11].

Таблица 1.

Места сбора образцов колорадского жука

Номер на карте	Название популяции	Дата сбора	Географические координаты
1	Псковская	2007	57° 49′ 0″ с.ш., 28° 20′ 0″ в.д.
2	Пушкинская	2007	59° 44′ 0″ с.ш., 30° 23′ 0″ в.д.
3	Харьковская	2003	49° 55′ 0″ с.ш., 36° 19′ 0″ в.д.
4	Новосибирская	2007	55° 1′ 0″ с.ш., 82° 56′ 0″ в.д.
5	Алма-Атинская	2007	43° 16′ 39″ с.ш., 76° 53′ 44″ в.д.
6	Белгородская	2007	50° 37′ 0″ с.ш., 36° 35′ 0″ в.д.
7	Кумертаусская	2006	52° 46′ 0″ с.ш., 55° 47′ 0″ в.д.
8	Янаульская	2008	56° 16′ 0″ с.ш., 54° 56′ 0″ в.д.
9	Кигинская	2008	55° 24′ 0″ с.ш., 58° 36′30″ в.д.

Анализ генетического полиморфизма

Для генетического анализа из выборки были случайно взято по 30 особей для каждой популяции. ДНК выделяли из трёх простерилизованных в этаноле лапок от каждого жука с использованием набора реактивов для выделения ДНК Qiagen Blood DNA kit и протокола выделения King Fisher согласно протоколу производителя для выделения ДНК из тканей животных.

Амплификация и анализ генов AChE и LdVssc1. Двунаправленная ПЦР амплификация (bi-PASA) проводилась, как описано в [12]. ПЦР проводили в смеси объёмом 25 µl и содержащей: 11,05 µl бидистиллированной воды, 2,5 µl 10×PCR буфера (Biotools), 0,75 µl MgCl₂ (50mM)_, 2,5 µl dNTPs (2 mM), 1 µl каждого из 3-х праймеров (5µM) (использовалсь только один аллель-специфичный праймер на смесь), 0,2 µl Taq-плимеразы (0,5 U) (Biotools) и 1 µl геномной ДНК-матрицы.

ПЦР-амплификация аллель специфичных фрагментов проводилась при режиме: один цикл при 95 ºC в течении 2 мин; два цикла при 94 ºC в течении 30 сек, 58 ºC в течении 30 сек и 72 ºC в течении 1 мин; 16 циклов при 94 ºC в течении 30 сек, 57 ºC в течении 30 сек и 72 ºC в течении 1 мин; 17 циклов при 94 ºC в течении 30 сек, 56 ºC в течении 30 сек и 72 ºC в течении 1 мин. Амплификация ДНК проводилась в 96-ти луночных плашках для ПЦР «Axygen», в приборе Bio-Rad C1000 Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories). После проведения ПЦР полученный продукт визуализировался в ультрафиолетовом свете.

результаты и их обсуждения

Вначале нами был проведён анализ фенетического полиморфизма в популяциях колорадского жука на территории вторичного ареала. На основе полученных частот вариаций фенов был рассчитан уровень разнообразия (среднее число вариаций µ) и построены изолинии его распределения. Наиболее интересные результаты при этом были получены для вариаций фена рисунка темени (прослеживается клинальный полиморфизм в юго-западном направлении) и фена рисунка переднеспинки (клина в широтном направлении ).

Для оценки ДНК полиморфизма в популяциях колорадского жука изучался полиморфизм фрагментов двух генов: электрон-чувствительного натриевого канала (LdVssc1) и ацетилхолинэстеразы (AChE). Известно, что однонуклеотидный полиморфизм СТ в гене LdVssc1 характеризует устойчивыечувствительные к перметрину генотипы колорадского жука соответственно [13]. Мутация AG в гене AChE приводит к резистентности колорадского жука к фосфорорганическим инсектицидам [14].

Наибольшая частота резистентного генотипа RR гена AChE была отмечена для Белгородской и Янаульской популяций (частота 1.00), наименьшая для Новосибирской (частота 0.033). Для гена LdVssc1 наибольшая частота резистентного генотипа RR была отмечена для Харьковской (0.793), наименьшая – для Белгородской (0.414).

Таким образом, нами был проведён комплексный популяционно-фенетический анализ колорадского жука на территории вторичного ареала. На наш взгляд, распределение частот рассматриваемых генов отражает закономерность как исторического хода расселения вида на территории евразийской части ареала, так и современного состояния с резистентностью колорадского жука к инсектицидам.

литература

1. Ушатинская Р.С. Колорадский картофельный жук. Филогения, морфология, физиология, экология, адаптация, естественные враги. М.: Наука, 1981. 377 с.

2. Фасулати С.Р. Территориальное расселение колорадского жука в северных районах картофелеводства. // Экологические аспекты интенсификации сельскохозяйственного производства. Материалы международной научно-практической конференции. Пенза. 2002. С. 205 - 207.

3. Яблоков А.В. Популяционная биология. М.: Высшая школа, 1987. 303 с.

4. Roderick G.K. Geographic structure of insect populations: gene flow, phylogeography, and their uses // Annual Rev. Entomology 1996. № 41. P. 325-352.

5. Loxdale H.D., Lushai G. Molecular markers in entomology // Bulletin of Entomological Research. 1998. № 88. P. 577 – 600.

6. Климец Е.П. Выявление чувствительности колорадского жука к действию инсектицидов с помощью фенов // Фенетика природных популяций. М. 1988. С. 111 – 117.

7. Беньковская Г.В., Удалов М.Б., Поскряков А.В., Николенко А.Г. Феногенетический полиморфизм колорадского жука Leptinotarsa decemlineata Say и его чувствительность к инсектицидам на территории Башкирии // Агрохимия. 2004. №12. С. 23 – 28.

8. Беньковская Г.В., Удалов М.Б., Хуснутдинова Э.К. Генетическая основа и фенотипические проявления резистентности колорадского жука к фосфорорганическим инсектицидам // Генетика. 2008. Т. 44. № 5. С. 638 – 644.

9. Фасулати С.Р. Полиморфизм и популяционная структура колорадского жука Leptinotarsa decemlineata Say в Европейской части СССР // Экология. 1985. № 6. С. 50 – 56.

10. Животовский Л.А. Показатели популяционной изменчивости по полиморфным признакам // Фенетика популяций. М. 1982. С. 38 – 44.

11. Raymond M, Rousset F. GENEPOP (version 1.2): population genetics software for exact tests and ecumenicism. Journal of Heredity. 1995. №86. P. 248–249.

12. Clark J.M., Lee S.H., Kim H.J., Yoon K.S., Zhang A. DNA-based genotyping techniques for the detection of point mutation associated with insecticide resistance in Colorado potato beetle Leptinotarsa decemlineata. // Pest Management Science. 2001. № 57. Р. 968-974.

13. Lee S.H., Dunn J.B., Clark J.M., and Soderlund, D.M. Molecular analysis of kdr-like resistance in a permetrin-resistant strain of Colorado potato beetle. // Pesticide biochemistry and physiology. 1999. № 63. P. 63 – 75.

14. Zhu Y.K., Lee S.H., Clark J.M. A point mutation of acetylcholinesterase associated with azinphosmethyl resistance and reduced fitness in colorado potato beetle // Pesticide biochemistry and physiology. 1996. № 55. P. 100 – 108.

Код для цитирования: Скопировать