V Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2013

Методы атомно-силовой микроскопии (АСМ) находят все более широкое применение в биологии, медицине и фармакологии. Это связано с рядом преимуществ АСМ перед оптической и электронной микроскопией. Атомно-силовой микроскоп позволяет получать истинно трехмерный рельеф исследуемой поверхности, производить измерения на воздухе, в жидкости, в вакууме, в атмосфере любого газа, что открывает широкие возможности для изучения биомолекул и живых клеток. В настоящее время атомно-силовой микроскоп используют для визуализации с высоким разрешением и оценки локальных механических свойств биологических нанообъектов. АСМ позволяет более глубоко изучать клеточные процессы, выяснять такие важнейшие свойства, как эластичность, мобильность поверхностных слоев, адгезия, молекулярное связывание и электростатичность. Несмотря на достижения в области применения сканирующей зондовой микроскопии, остается много нерешенных проблем, т. к. она сталкивается с рядом специфических ограничений и трудностей, связанных с самой природой биологических объектов [6]. Их преодоление будет способствовать развитию новых методов выявления, диагностики и лечения ряда заболеваний. В связи с этой проблемой нами планируется исследование молекулярной структуры клеточной мембраны, адгезии, электростатичности эритроцитов крови человека в норме и патологии на примере инсулиннезависимого сахарного диабета в условиях in vivo и in vitro при фотокорекции некогерентным светодиодным излучением красного диапазона методом атомно-силовой микроскопии[6,8]. Изучение с помощью АСМ клеточной поверхности и локального модуля упругости клеток крови на ранних стадиях формирования осложнений инсулиннезависимого сахарного диабета позволит выявить структурные особенности и вязко-упругие свойства мембраны эритроцитов, при нарушении транспорта глюкозы через клеточную мембрану, а также позволит разработать диагностические системы, выявляющие ранние признаки развития заболевания.

Целью настоящего проекта является исследование структурно-функционального состояния клеточной мембраны эритроцитов после воздействия светодиодного излучения красного диапазона на здоровых доноров и больных инсулиннезависимым сахарным диабетом в условиях in vitro методом атомно-силовой микроскопии.

Задачи проекта:

1) Разработка наиболее адекватного способа приготовления эритроцитов для их изучения с помощью атомно-силового микроскопа;

2)изучение молекулярной структуры мембраны эритроцитов в норме и при сахарном диабете;

3)оценка вязко-упругих свойств поверхности изучаемых клеток;

4) оценка воздействия некогерентного красного диапазона на молекулярную структуру и свойства мембраны эритроцитов in vitro.

Материалы и методы.

В экспериментах использовали эритроциты крови, которые традиционно служат моделью для оценки глубины повреждения мембран на молекулярном уровне при патологических процессах, протекающих в организме. Эритроциты крови здоровых доноров, больных инсулиннезависимым сахарным диабетом (ИНСД) выделяли по стандартной методике [8]. Опытную группу обследованных составили больные ИНСД 49-71 лет. Возраст здоровых доноров в группе составлял 49 до 60 лет. Из каждой исследуемой группы были взяты пробы крови. Эритроциты крови здоровых доноров и больных инсулиннезависимым сахарным диабетом (ИНСД) выделяли по стандартной методике.

Проводили сканирование 50 клеток из каждой исследуемой группы в контактном режиме на воздухе.

Исследуемые клетки доноров и больных сахарным диабетом были разделены на следующие группы:

СДИКСС/группа доноров	Наименование группы
без воздействия/условно здоровые доноры	Интактная группа №1
без воздействия/больных сахарным диабетом 2 типа (ИНСД)	Интактная группа №2
воздействие в дозе 1,69 Дж/см2/условно здоровые доноры	Опытная группа №1
воздействие в дозе 1,69 Дж/см2/ больных сахарным диабетом 2 типа (ИНСД)	Опытная группа №2
воздействие в дозе 4,23 Дж/см2/условно здоровые доноры	Опытная группа №3
воздействие в дозе 4,23 Дж/см2/ больных сахарным диабетом 2 типа (ИНСД)	Опытная группа №4
воздействие в дозе 8,46 Дж/см2/условно здоровые доноры	Опытная группа №5
воздействие в дозе 8,46 Дж/см2/ больных сахарным диабетом 2 типа (ИНСД)	Опытная группа №6

Диагноз сахарного диабета ставился на основании клинико-лабораторного обследования в отделении эндокринологии ГУЗ «Ульяновская областная клиническая больница № 1». Больные с ИНСД получали человеческий рекомбинантный инсулин в индивидуальной дозе по интенсифицированной схеме. На все виды исследований были получены разрешения этической комиссии Ульяновского госуниверситета. Исследования проводились с соблюдением прав и свобод, определённых законодательством РФ, этическими нормами и принципами в соответствии с Декларацией Хельсинки (1964) со всеми последующими дополнениями и изменениями, регламентирующих научные исследования на человеке, а также международным руководством для биомедицинских исследований с вовлечением человека (International ethical guidelines for biomedical research involving human subjects) Совета международных организаций медицинских наук (CIOMS). Все первичные результаты исследований были обезличены в соответствии требованиями п. 3 ст. 6 действующего Федерального закона РФ 152-ФЗ «О персональных данных».

Упруго-вязкостные свойства клеточной мембраны эритроцитов оценивали с помощью модуля изометрического сжатия мембраны (модуля Юнга), характеризующего способность клетки к деформациям, возникающим при взаимодействии мембраны с вершиной зонда АСМ, и чем больше его значения, тем меньше упругие деформации клетки[1,8]. Модуль Юнга (MPa) клеточной мембраны эритроцитов измеряли методом атомно-силовой спектроскопии. Для расчета модуля Юнга использовали модель Герца . Для исследования поверхности эритроцитов использовали сканирующий зондовый микроскоп Solver P47-PRO (ЦНТИМ). Использовались неконтактные кремниевые зонды серии NSG10 (NT-MDT) с жесткостью 5,5 Н/м, резонансной частотой приблизительно 150 кГц, радиусом закругления 10 нм, высота зонда 10-20 мкм[8].

В качестве источника светодиодного излучения красного диапазона света использовался прибор (рис.1.), изготовленный на кафедре оптики и спектроскопии твердого тела физического факультета УлГУ под руководством профессора С.В. Булярского (свидетельство на полезную модель № 10096, выданное 16.06.1999г). Излучающим устройством в нем являются светоизлучающие диоды, представляющие собой арсенид-галлий-алюминиевые кристаллы красного цвета свечения (длина волны 620-680 нм; диапазон энергий квантов излучения 1,91-1,65 һv), помещенные в пластмассовый корпус в сочетании с блоком питания, вырабатывающим ток заданной формы для работы данных кристаллов. Источник характеризуется следующими параметрами: средняя мощность излучения – 2,5 мВт; импульсная мощность излучения – 5 мВт; частота повторения импульса – 50 Гц; длительность импульса – 5 мсек; время экспозиции 10 минут. Светодиодное излучение красного диапазона в животных клетках практически не поглощается, благодаря чему оно проникает на глубину до 80 мм. Изучаемый источник формирует широкие монохроматические пучки некогерентного излучения с шириной спектра 1-10 нм. Благодаря чему он более предпочтителен в фототерапевтической практике[6,8].

Рис.1.СДИКД

Полученные экспериментальные данные анализировали в программе Nova, Matlab. Статистическую обработку данных проводили с использованием лицензионной компьютерной программы «Statistica 6.0» StatSoft Inc. (США) с использованием непараметрической статистики по правилам, рекомендованным международным комитетом редакторов биомедицинских журналов (ICMJE). Достоверность различий оценивали на основе U-критерия Манна-Уитни, за достоверность принимали различия на уровне значимости 95% (p> E_soft); µ - коэффициент Пуассона. В силу того, что коэффициент Пуассона имеет значения, лежащие в интервале от 0 до 0,5 (0≤ µ_soft≤ 0,5), погрешность, вносимая им, пренебрежимо мала. За счёт этого можно уростить выражение (2) до вида E* ≈ E_soft .

Для получения значений модуля Юнга с использование модели Герца следует преобразить «силовые кривые», получаемые в эксперименте. С этой целью осуществляется переход от системы координат D - zк системе F - ∆h,где D – ток рассогласования фотодиода; z – расстояние, на которое перемещается кантилевер пьезосканером АСМ при подводе к поверхности.

Рис. 7. а – силовые кривые, полученные из АСС эксперимента в координатах D – z: сплошная кривая – биологический объект, штрихпунктирная – стекло, А – В – прямолинейный участок, по которому рассчитывается тангенс угла наклона; b – силовые кривые в координатах F - ∆h после преобразования по формуле (3): сплошная кривая – биологический объект, пунктирная – стекло. Участок Q-P соответствует отсутствию взаимодействия зонда с поверхностью; с – зависимость силы, действующей на образец, от глубины проникновения зонда в образец (точки) и результат аппроксимации этой зависимости функцией (1) – сплошная линия.

Такое преобразование необходимо, так как отколнение балки от положения равновесия регестрируется с помощью четырехсекционного фотодиода и выражается через ток рассогласования мекжду верхней и нижней секциями. Данный переход осуществляется в несколько этапов. В первую очередь, надо перевести сигнал рассогласования фотодиода в силу взаимодействия по формуле

(3)

где k_tip – коэффициет жесткости АСМ-зонда; D_soft– ток рассогласования фотодиода, полученный на образце;a=D_glass/Z_glass– тангенс угла наклона на линейном участкеA – Bсиловой кривой, полученный на стекле (рис.6,а). Параметр а показывает, на сколько изменится ток рассогласования фотодиода в зависимости от того, как сильно прогибается балка кантилевера.

Для дальнейших расчётов модуля Юнга на одном графике строятся силовые кривые, полученные на исследуемом образце и на стекле (реперная кривая).

При определении момента касания зондом поверхности (точкаQ)предполагается, что пока участкиQ-Pкривой, полученной на стекле и кривой, полученной на биологическом образце совпадают, зонд не коснулся образца (рис. 6,б). При совмещении кривых в точке касания Q разность перемещений пьезосканера (Z_glass – Z_soft), при которых зонд оказывает одинаковое давление на стекло и мягкий биологический образец, показывает, на какую глубину (∆h) зонд проникает в поверхность исследуемого образца. После этого строится зависимость силы, действующей на образец, от глубины проникновения в образец зонда – F( ∆h). Для нахождения E* полученная зависимость апроксимируется формулой (1) с использованием метода наименьших квадратов (рис. 6,с). Значение параметра E*, при котором экспериментальная и расчётная кривые совпадают, соответствует абсолютному значению модуля Юнга исследуемого объекта (при условии, что E* ≈ E_soft).

Разработка адекватного способа приготовления эритроцитов и лейкоцитов крови человека для исследования на АСМ.

Для изучения различных объектов их предварительно фиксируют. Фиксация способствует закреплению материала на стекле, даёт возможность изучать материал. Электронная, световая микроскопия – это те области, где методы приготовления и фиксации препаратов к исследованию давно разработаны. Но атомно-силовой микроскоп работает по иному принципу. Поэтому, для работы с ним, подбор фиксации препарата является важным этапом в моих исследованиях.

1) При сканировании эритроцитов, фиксированных метанолом в течение 10 минут наблюдается кучкование и слипание клеток с образованием «стопок» или «столбиков» (рис. 8). При выдержке эритроцитов в фиксаторе в течение 1-5 минут слипание клеток на препарате уменьшается, но скан характеризуется помутнением и размытостью препарата.

Рис.8. Эритроциты фиксированные метанолом

2) Эритроциты, фиксированные 2,5% глютаровым альдегидом, при сканировании на АСМ, теряют свою нативную форму, происходит искажение мембраны. Наблюдаются сходные результаты с эритроцитами, фиксированными метанолом.

3) Сканирование препаратов эритроцитов, высушенных на воздухе, даёт четкие хорошие изображения клеток, которые свободно располагаются на предметном стекле. Мембрана сохраняется без изменений ( рис. 9).

Рис.9.Эритроциты,высушенные на воздухе

Поэтому для проведения измерений, снятия параметров и оценки морфологических и вязкоупругих свойств был выбран именно этот способ подготовки препаратов клеток (рис. 10).

Рис.10.Измерение морфологических параметров эритроцита (диаметра, высоты вогнутой и выпуклой части клетки)

Изучение вязкоупругих свойств цитоплазматической мембраны эритроцитов условно здоровых доноров при воздействии СДИКД invitro

Повышение показателя модуля Юнга или упругости, свидетельствует о снижении эластичности и вязкости клеточной мембраны, и повышении жесткости мембраны. При снижении показателя упругости, происходит повышение эластичности и увеличение вязкости, при одновременном снижении жесткости клеточной мембраны эритроцитов.

Рис. 11. Показатели модуля Юнга цитоплазматической мембраны эритроцитов условно здоровых доноров при облучении СДИКД.

У эритроцитов интактной группы №1модуль Юнга в выпуклой части равен 0,003 ±0,03 МРа, а в вогнутой части – 0,0011 ± 0,009МРа. Эти показатели характеризуют упругость цитоплазматической мембраны эритроцитов условно здоровых доноров (рис. 11).

После воздействия красным светом 1,69 Дж/см² эритроцитов (опытной группы №1) наблюдается снижение модуль Юнга в выпуклой области равен 0,0002 ±0,0009 МРа (р

Код для цитирования: Скопировать