IV Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2012

Введение

«...С тех пор, как биологию стали разрабатывать в свете эволюционной теории, в области органической природы также начали исчезать одна за другой застывшие разграничительные линии классификации; с каждым днем множатся почти не поддающиеся классификации промежуточные звенья, более точное исследование перебрасывает организмы из одного класса в другой, и отличительные признаки, ставшие почти символом веры, теряют свое безусловное значение...»

Ф.Энгельс. "Анти-Дюринг"

Актуальность исследования. Со времени открытия микроорганизмов постоянно возникал вопрос о роли и механизмах воздействия микрофлоры на организм человека и животных. Воззрения на микрофлору менялись в зависимости от уровня ее познания. Можно условно выделить несколько основных этапов в развитии учения о микробиоценозе:

1 - ´´эвристический" - это открытие Левенгуком присутствия в организме человека и животных микроорганизмов;

2 - ´´накопительный´´ - включает исследования по обнаружению и идентификации микроорганизмов в различных биотопах. Начинается изучение не только агрессивной, но и защитной роли отдельных видов микроорганизмов в жизни человека и животных На этом этапе исследованиями в данной области занимались A. Nissle, И.И. Мечников, Л.Г. Перетц, Н.Ф. Гамалея, Г.Н. Габричевский и др.;

3 - этап ´´детализации´´ (80-90-е годы XX века), когда широкое использование современных методов культивирования облигатно-анаэробных бактерий и использование принципов гнотобиологии дали возможность начать прицельное изучение роли нормальной микрофлоры и ее отдельных представителей в поддержании гомеостаза макроорганизма, а также оценить ее роль в возникновении некоторых патологических состояний, вызванных различными представителями микрофлоры. На этом этапе исследования в данной области проводили О.В. Чахава, А.О. Тамм, Б.А. Шендеров и др.;

 4 - ´´аналитический" (конец 90-х годов), основанный на изучении молекулярных и биохимических механизмов, управляющих связью микробиоты и организма-хозяина, позволил констатировать масштаб той пользы, которую получает человек и животное от симбиоза с микрофлорой, и выяснить возможные причины перехода от ´´благополучного сосуществования´´ к взаимной агрессии. На этом этапе исследованиями в данной области занимались И.В. Домарадский, В.Н. Бабин, А.В. Дубинин, О.Н. Минушкин, М.Д. Ардатская и др.

Необходимо отметить, что именно на последнем этапе была создана основа для формулирования принципиально нового воззрения на состояние микробиоценоза с позиций клинической медицины. Однако, несмотря на успехи, достигнутые в конце XX века, среди большинства практикующих врачей бытует устаревшее представление о "дисбактериозе", что приводит к его гиперболизации и недооценке основной патологии, приведшей к нарушениям микрофлоры [1].

В любом микробиоценозе различают характерную для данного вида и случайную микрофлору. Установлено, что нормальная микрофлора осуществляет внутри макроорганизма множество функций: участвует в регуляции газового состава кишечника и других полостей организма хозяина; продуцирует энзимы, участвующие в метаболизме белков, углеводов, липидов и нуклеиновых кислот; продуцирует биологически активные соединения (витамины, антибиотики, токсины, и т.д.), обеспечивает колонизационную резистентность.

Как говорилось ранее, важнейшей функцией нормальной микрофлоры является ее участие в кооперации с организмом хозяина в обеспечении колонизационной резистентности, под которой подразумевается совокупность механизмов, придающих стабильность нормальной микрофлоре и обеспечивающих предотвращение заселения организма хозяина посторонними микроорганизмами. В случае снижения колонизационной резистентности (в первую очередь уменьшения бифидо- и лактофлоры) увеличивается число и спектр потенциально-патогенных микроорганизмов, происходит транслокация их  и производимых ими токсинов через стенку кишечника или других полостей, что может сопровождаться возникновением эндогенной инфекции. Чаще всего снижение колонизационной резистентности сопровождается развитием различных заболеваний желудочно-кишечного тракта [25].

В связи с вышеизложенным, выявляется необходимость в более детальном изучении проблем, связанных с симбиотическим взаимодействием организма хозяина с его собственной микрофлорой. В современном представлении, кишечная микрофлора является важной составляющей организма хозяина, которая осуществляет в нем многие физиологические процессы и непременно реагирует на какие-либо внутрисистемные изменения. В связи  этим  встает вопрос об изучении изменений микрофлоры желудочно-кишечного тракта под влиянием различных патологических процессов.

Идеальной моделью изучения таких процессов в организме человека могут служить крысы, поскольку некоторые процессы, происходящие в организме крысы, сходны с таковыми у человека, что позволяет считать этих животных биологической моделью для изучения ряда физиологических явлений, происходящих в организме человека. Кроме того, подобно людям, крысы обитают преимущественно в городах, едят ту же пищу. На крысах испытывают новые лекарственные препараты, новые методы работы с геномом, на них проверяют свои теории психологи, физиологи, нейрофизиологи.

Имеются данные о схожести микрофлоры некоторых частей пищеварительного тракта человека и крысы. В своих работах Корнеев М.Л. с соавторами (2006 г.) доказали, что данная биологическая модель (крысы) пригодна для изучения пристеночного биотопа желудочно-кишечного тракта.

Цель и задачи исследования.

Цель исследования -  изучение изменений структуры микробиоценоза прямой кишки помесных пасюков при дизбактериозах и гепатозах в условиях промышленного центра - Красноярска.

Основные задачи:

• - изучить структуру микробиоценоза прямой кишки клинически здоровых помесных пасюков;
• - изучить изменения структуры микробиоценоз прямой кишки помесных пасюков с признаками дисбактериоза.
• - изучить изменения структуры микробиоценоза прямой кишки помесных пасюков с клиническими и ультрасонографическими признаками гепатоза.

Научная новизна. Впервые применен комплексный подход к исследованию симбиотического взаимодействия состава микрофлоры прямой кишки клинически здоровых помесных пасюков, обитающих в городе Красноярске,  а  так же изменения, имеющие место при патологических процессах, происходящих в пищеварительной системе.

Практическая значимость.

Полученные экспериментальные данные могут служить для дальнейшего изучения процессов, происходящих в организме крысы, являющейся моделью для  изучения процессов в организме человека. Данные материалы так же могут использоваться для обучения студентов по курсу «Ветеринарная микробиология».

Апробация работы. Результаты работы были доложены на VI Всероссийской студенческой научной конференции «Студенческая наука - взгляд в будущее», которая проходила 30 марта 2011 года в ФГОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет», г. Красноярск.

1. Обзор литературы

1.1 Видовой состав нормальной микрофлоры пищеварительного тракта млекопитающих

Общая численность микроорганизмов, обитающих в различных биотопах человеческого организма, достигает величины порядка 10¹⁵, т.е. число микробных клеток примерно на два порядка превышает численность собственных клеток макроорганизма. Отношения в этом сообществе имеют филогенетически древнее происхождение и жизненно важны для обеих частей системы организм-микробиота [7, 8, 11, 17].

Значительная часть (более 60%) микрофлоры заселяет различные отделы пищеварительного тракта. Примерно 15-16% микроорганизмов приходится на ротоглотку. Урогенитальный тракт, исключая вагинальный отдел (9%), заселен довольно слабо (2%); остальная часть приходится на кожные покровы (12%) [13, 24, 26].

В любом микробиоценозе, в том числе кишечном, всегда имеются постоянно обитающие виды бактерий, которые составляют 90% (главная, автохтонная, индигенная, резидентная микрофлора), сопутствующая (факультативная) - около 10% и транзиторныая (случайные виды, аллохтонная, остаточная микрофлора) - 0,01% [13, 14, 26].

Видовой состав нормальной микрофлоры пищеварительного тракта представлен следующими родами микроорганизмов: 

полость рта: Actinomyces, Arachnia, Bacteroides, Bifidobacterium, Eubacterium, Fusobacterium, Lactobacillus, Propionibacterium, Spirochetes, Streptococcus, Vellionella и др.

слизистая желудок: Lactobacillus,  Streptococcus, Sarcina и др.

 Ранее считалось, что тонкая кишка стерильна. Однако установлено, что в физиологических условиях содержание бактерий в тонкой кишке колеблется от 10⁴ на 1 мл содержимого в тощей кишке до 10⁷ на 1 мл в подвздошной, при этом в проксимальных отделах тонкой кишки обнаруживаются преимущественно грамположительные аэробные бактерии, в дистальных - грамотрицательные энтеробактерии и анаэробы родов [24]: Bifidobacterium, Lactobacillus, Vellionella,. Clostridium, Eubacterium, Peptococcus и др.

Доминирующая микрофлора толстой кишки включает в себя анаэробные бактерии родов Bacteroides, Вifidobacterium. Аэробные бактерии, представленные кишечными палочками, лактобациллами, энтерококками и др., составляют сопутствующую микрофлору. К остаточной микрофлоре относят стафилококки, клостридии, протей, грибы [13, 21, 26]. Однако такое деление крайне условно. В толстой кишке человека и животных в различном количестве присутствуют бактерии родов Actinomyces, Bacillus, Сitrobacter, Сorynebacterium, Enterobacter, Peptococcus, РeptoStreptococcus, Рseudomonas, Veillonella, Аcidominococcus, Аnaerovibrio, Вutyrovibrio, Acetovibrio, Campylobacter, Disulfomonas, Eubacterium, Fusobacterium, Propionobacterium, Roseburia, Ruminococcus, Selenomonas, Spirochetes, Succinomonas, Wolinella. Помимо указанных групп микроорганизмов можно обнаружить также представителей и других анаэробных бактерий (Gemiger, Anaerobiospirillum, Metanobrevibacter, Megasphaera, Bilophila), различных представителей непатогенных простейших родов Chilomastix, Endolimax, Entamoeba, Enteromonas и более десяти кишечных вирусов [1, 26, 27]. Такие представители микрофлоры, как энтеробактерии, включая кишечную палочку, стафилококки, грибы и другие аэробы, составляют не многим более 1 - 4 %.

Семейство Enterobacteriaceae включает в себя небольшие подвижные или неподвижные споронеобразующие палочки. Некоторые бактерии имеют капсулы, особенно при первичном выделении из клинических образцов. Являются аэробами или факультативными анаэробами; большинство растет на простых питательных средах с мясным экстрактом, некоторые имеют специфические потребности при росте. На большинстве плотных сред образуют круглые выпуклые и блестящие (иногда слизистые) S-колонии. Также могут формировать плоские, неровные и зернистые R-колонии (часто их формирование обусловлено потерей капсулы). Высокоподвижные виды дают "феномен роения" на плотной среде. Большинство энтеробактерий не пигментировано, хотя отдельные штаммы и виды могут продуцировать красный, розовый, желтый или голубой пигмент.  

Энтеробактерии характеризуются дыхательным и бродильным метаболизмом. Разлагают глюкозу, другие углеводы и спирты с образованием кислоты и газа, но существуют и газонеобразующие виды. Каталазаположительны (исключая один серотип рода Shigella), оксидазаотрицательны. Восстанавливают нитраты до нитритов (исключая некоторых представителей родов Enterobacter, Erwinia, Klebsiella и Yersinia), не нуждаются для роста в присутствии NaCl. Это семейство включает более 20 родов, объединяющих более 100 видов бактерий, обитающих на растениях, в почве, входящих в состав микробных ассоциаций кишечника животных и человека.

Анализируя видовой, численный состав и инфраструктуру микробиоценоза макроорганизма, можно кратко сформулировать три основных положения: первое - общее число видов более 500, второе - к основным по своей патогенетической сущности следует отнести род бифидобактерий и семейство бактероидов (последнее в связи с трудностью анаэробного культивирования и, следовательно, с высокой стоимостью исследования во многих лабораториях не определяется), третье - отношение анаэробов к аэробам в норме постоянно: 10:1 (или 10²-3:1), в зависимости от биотопа [7, 17, 32, 41]. Облигатных и факультативных анаэробов всегда на порядок больше аэробов, как в "анаэробных органах" - толстая кишка, так и на кожных покровах. Это достигается благодаря наличию своеобразной зоны в области, непосредственно прилегающей к эпителию. Основная особенность этой зоны состоит в том, что в ней, благодаря работе натриевых насосов на плазматических мембранах эпителиоцитов и своеобразию структуры поверхностных гликопротеидов, поддерживается отрицательный потенциал [7]. В различных отделах величины его колеблются от -50 до -220 мВ. Кислород и его токсичные метаболиты (супероксид-ион и т.д.) в этой зоне в норме отсутствуют. Этим же объясняется и ´´этажность´´ расселения различных видов бактерий по вертикали: в непосредственном адгезивном контакте с эпителием находятся строгие анаэробы (бифидобактерии, бактероиды), далее располагаются факультативные анаэробы, еще выше - аэробы [7, 8, 34, 37, 38].

1.2 Понятие синдром избыточного бактериального роста (дисбактериоз) и причины их возникновения

Согласно различным этапам учения о микробиоценозе кишечника было принято несколько определений дисбактериоза.

Впервые данный термин был введен A. Nissle в 1916 г., который под дисбактериозом первоначально понимал изменения, касающиеся только кишечной палочки.

Л.Г. Перетц (1962 г.) определял дисбактериоз как патологическое состояние кишечной микрофлоры, которое характеризуется уменьшением общего количества типичных кишечных палочек, понижением их антагонистической и ферментативной активности, появлением лактозонегативных эшерихий и кишечных палочек, дающих гемолиз на кровяном агаре, увеличением количества гнилостных, гноеродных, спороносных и других видов микробов.

 В определении А.М. Уголева (1972 г.) дисбактериоз характеризовался как изменением качественного и количественного состава бактериальной флоры кишечника, возникающим под влиянием различных факторов: характера питания, изменения перистальтики кишечника, возраста, воспалительных процессов, лечения антибактериальными препаратами, изменения физико-химических условий жизнедеятельности бактерий (физический, психический стресс, тяжелые заболевания, оперативные вмешательства, экстремальные условия, которым подвергается человек при длительном пребывании в нехарактерных для него зонах обитания, - спелеологические, высокогорные, подводные, арктические и антарктические зоны; различные загрязнения окружающей среды; иммунодефицитные состояния; нарушения пищеварения с попаданием значительного количества питательных веществ в среду микробного обитания; голодание и т.д.).

Главной особенностью, позволяющей отнести это биологическое явление к дисбактериозу, по мнению А.М. Уголева, является стойкий его характер и нарушенные механизмы аутостабилизации [1].

До настоящего времени широко использовалось и другое определение дисбактериоза как состояния, характеризующегося нарушением подвижного равновесия кишечной микрофлоры и возникновением качественных и количественных изменений в микробном пейзаже кишечника (В.Н. Красноголовец, 1989) [13].

Некоторыми авторами [2, 17, 19] дисбактериоз (не только кишечника) рассматривался как изменение микробиоценозов различных биотопов человеческого организма, выражающееся в нарушении инфраструктурного отношения анаэробы/аэробы, популяционных изменениях численности и состава микробных видов биотопов, в том числе в появлении нерезидентных для данного биотопа видов (контаминация, транслокация), изменения их метаболической активности, что является следствием и/или одним из патогенетических механизмов многих патологических состояний.

Термин "дисбактериоз" присутствует только в отечественной литературе. Анализ источников литературы, проведенный В.В. Василенко [10], показал, что данный термин "присутствует в заголовках 257 научных работ, опубликованных с 1966 по 2000 г., 250 из них - в русскоязычных медицинских журналах, еще 4 принадлежат авторам из стран прежнего социалистического лагеря".

Но, как видно из представленных определений, "дисбактериоз" - не столько клиническое понятие, сколько микробиологический (лабораторный) термин, и по своей сути является следствием воздействия неблагоприятных факторов, в том числе различных заболеваний.

В зарубежной литературе применяется термин "Bacterial overgrowth syndrome" - синдром избыточного бактериального роста [27, 28, 31, 33, 37, 39, 41], включающий в себя изменение количественного и видового состава микроорганизмов, характерных для биотопа, и в ряде случаев включает феномены контаминации и транслокации [29, 30, 35, 36, 40].

Основное отличие понятия "синдром избыточного бактериального роста" от термина "дисбактериоз кишечника" заключается не столько в терминологических нюансах, сколько в том содержании, которое в него вкладывается: при синдроме избыточного бактериального роста речь идет не об изменении "микробного пейзажа" толстой кишки, а об изменении состава микрофлоры тонкой кишки.

К причинам синдрома избыточного бактериального роста можно отнести причины экзогенной и эндогенной природы.

  К экзогенным факторам относятся: климатогеографические и экологические условия, такие как химическое загрязнение, радиационные воздействия, характер и качество питания, санитарно-гигиенические условия и др.

  К эндогенным факторам, способствующим изменениям нормальной микрофлоры, прежде всего, относят:

а) заболевания желудочно-кишечного тракта бактериальной и вирусной природы, такие как дизентерия, сальмонеллез, стафилококковые энтероколиты, ротавирусная инфекция, иерсиниоз и др. Под влиянием возбудителей кишечных инфекций происходит нарушение динамического равновесия между иммунным статусом макроорганизма и заселяющей кишечник флорой, снижается скорость обновления эпителия, индуцируются атрофические процессы;

б) длительный и нерациональный прием антибиотиков, которые оказывают прямое подавление как патогенной, так и нормальной микрофлоры, токсическое действие на эпителий, подавляют активность желез желудочно-кишечного тракта, отрицательно воздействуют не иммунитет. Кроме антибактериальных препаратов к развитию дисбактериоза могут приводить салицилаты (ПАСК), которые стимулируют рост гемолизирующих палочек, кокковых форм Campylobacter; кортикостероиды, увеличивающие рост грибов рода Candida; цитостатики, вызывающие атрофию кишечного эпителия и снижение синтеза Jg A, тем самым, способствуя возникновению дисбиотических нарушений;

в) наследственные заболевания, протекающие с синдромом нарушенного кишечного всасывания (целиакия, муковисцедоз, дисахаридазная недостаточность, экссудативная энтеропатия и др.);

г) анатомо-физиологические нарушения желудочно-кишечного тракта, возникшие в результате неправильного внутриутробного формирования органов или проведенного оперативного вмешательства (мегаколон, долихосигма, дивертикулы кишки, постоперационный спаечный процесс в кишечнике, образование свищей, стриктур и др.);

д) хронические заболевания и нарушения функции органов пищеварения, такие как хронические холецистит, гепатит, панкреатит, колит, гастрит, язвенная болезнь желудка и 12-перстной кишки. Возникая как синдром какого-либо заболевания, дисбактериоз в дальнейщем отягощает его течение и усугубляет хронизацию процесса;

е) алиментарные факторы: длительное неполноценное или несбалансированное питание (избыток белков, жиров или углеводов), искусственное или смешанное вскармливание, длительное парентеральное питание, голодание, неправильный режим питания и др. приводят к определенным изменениям микробного спектра кишки;

ж) нарушения иммунного статуса - врожденные и приобретенные иммунодефициты (первичная гипогаммаглобулинемия, дефицит JgA и др.), аутоиммунные заболевания (системная склеродермия, васкулиты), аллергические заболевания, длительный прием иммуносупрессантов, влияющих на состояние макроорганизма в целом, сказываются и на составе микрофлоры кишечника.

Таким образом, нарушение микробиоценоза кишечника является следствием органической или функциональной патологии не только желудочно-кишечного тракта , но и других органов и систем [3,4,5,6, 18, 23].

Учитывая изложенное, необходимо подчеркнуть, что диагноз формулируется согласно Международной классификации болезней 10-го пересмотра. Самостоятельной нозологической единицы "дисбактериоз" не существует.

Преходящие нарушения микробиоценоза под влиянием различных факторов, в первую очередь антибиотикотерапии, рассматриваются с позиции дисбактериальных реакций и требуют в большей степени проведения профилактических мероприятий.

1.3. Гепатоз - как фактор, способствующий изменениям микрофлоры пищеварительного тракта

Гепатоз - полиэтиологическое заболевание. В сложном патогенезе жировой дистрофии можно выделить два основных момента:

1. Повышение поступления жира в печень как следствие перегрузки пищевым жиром и углеводами, недостатка белков в пищевом рационе, обеднение печени гликогеном, уменьшение окисления жира в организме.

2. Затруднение выхода жира из печени вследствие недостатка липотропных факторов в пище: метионина, липокаина, холина, витамина В₁₂, а так же пониженного образование ферментов, регулирующих содержание жира в печени.

Причины, вызывающие жировую дистрофию печение, можно условно сгруппировать следующим образом: несбалансированность рационов, бактериальные факторы, интоксикация химическими веществами.

Основной экскректорной функцией печени является образование желчи и выделение ее в просвет кишечника. У больных животных в результате повреждения печеночных клеток образующаяся желчь получает возможность проникать в кровеносное русло. Уровень желчных пигментов в крови возрастает, и они начинают окрашивать ткани в желтый цвет. Особенно интенсивно окрашивается жировая ткань.  Достигнув определенного уровня, билирубин начинает выделяться почками и появляется в моче.

По мере развития заболевания функционально состояние печени прогрессивно снижается, расстраиваются все виды обмена веществ.

Нарушение белкового обмена проявляется в диспротеинонемии (изменении соотношения белковых фракций в сыворотке крови), накоплении в крови продуктов распада белков и т.д. Наиболее характерным для данного заболевания является снижение альбуминов в сыворотке крови (гипоальбуминемия) и увеличение количества бета-глобулинов, а особенно - гамма-глобулинов.

Нарушение белково-синтетической функции печени связано с перерождением и распадом большого числа печеночных клеток и угнетением деятельности оставшихся гепатоцитов, в которых образуются альбумины. По мнению профессора С.Я. Капланского, известную роль в развитии гипоальбуминенмии может играть и повышение проницаемости (в результате токсического поражения) кровеносных капилляров и переход альбуминов из сыворотки в ткань печени.

Таким образом, концентрация альбуминов в крови является показателем физиологического состояния печени. Низкий уровень альбуминов свидетельствует о тяжелом повреждении органа [20].

Нарушение углеводно-жирового обмена проявляется изменениями концентрации в крови сахара, холестерина, фракционного состава глюкопротеидов, липопротеидов и т.д.

У животных с начальными стадиями заболевания (в результате нарушения обмена веществ и усиления гликогенолиза) количество сахара в крови возрастает. На более поздних стадиях, вследствие истощения запасов гликогена в печени, у животных натощак развивается гипогликемия, а после приема пищи, в результате дефектов в превращениях глюкозы в гликоген, содержание сахара в крови может значительно превысить нормальные величины и продолжительное время оставаться на этом уровне.

Непосредственным результатом жировой инфильтрации печени является усиленное окисление жира с повышенным образованием кетоновых тел. В нормальных условиях жиры, вовлеченные в обмен, окисляются до конечных продуктов - углекислоты и воды. При нарушении функции печени этот процесс останавливается как бы посередине, в результате чего в крови накапливаются промежуточные продукты обмена - ацетон, ацетоуксусная и бетаоксимасляная кислоты.

Заболевание может протекать остро и хронически. Острая форма чаще наблюдается у молодняка. Смерть у таких животных наступает внезапно. При хроническом течении болезни клинические симптомы проявляются за 5 - 10 и более дней до наступления смерти. При внимательном наблюдении за поведением животного можно заметить появление первых отклонений от нормы. Такими признаками являются: периодическое ухудшение аппетита, вялость, животное недостаточно энергично передвигается, много времени проводит в домике, слабо реагирует на корм.

Эти вначале нерезко выраженные симптомы постепенно усиливаются, некоторые животные совершенно отказываются от корма. Шерстный покров теряет блеск, становится взъерошенным, видимые слизистые оболочки бледнеют и приобретают желтушный оттенок, иногда отмечаются явления подмокания. Появляются и патогномоничные признаки: жажда, шаткая походка, слабость, парез, а иногда и паралич тазовых конечностей, покачивание головы из стороны в сторону, круговые движения, судороги или эпилептоподобные припадки.  При ультразвуковом исследовании печени наблюдается число  эхоположительных сигналов и на мониторе получается картина светлой печени.

Нарушение жирового обмена начинается уже в кишечнике. У больных животных в связи со снижением секреторной функции печени количество и качество поступающей в двенадцатиперстную кишку желчи изменяется, и усвоение жиров нарушается [22].

Микрофлора пищеварительного тракта высокочувствительна ко всем изменениям, происходящим в любых системах  организма хозяина.  Например, Минушкин О.Н., Ардатская М.Д., Бабин В.Н., Дубинин А.В. в своих работах по изучению короткоцепочечных жирных кислот у больных с бронхолегочной патологией отметили выраженные изменения со стороны микрофлоры кишечника, что связывали с изменением динамики водорода. Неполное высвобождение Н₂ в легких, обусловленное наличием патологии, приводит к возврату и накоплению его в полости кишечника. Это в свою очередь вызывает смещение окислительно-восстановительного потенциала внутрипросветной среды в сторону резкоотрицательных значений, при которых блокируются ферредоксинсодержащие ферменты, обеспечивающие жизнедеятельность облигатных анаэробов [3, 16, 38].

 В литературе нет четких данных по изменению микрофлоры кишечника при гепатозах. Исходя из вышесказанного можно предположить, что кишечная микрофлора так же реагирует на данную патологию изменением своего качественного и количественного состава, что стало одной из задач нашего исследований.  

2. Материалы и методы исследования

2.1 Материал и схема опыта

Объектами исследований служили помесные пасюки:

• без видимых клинических нарушений;
• с признаками синдрома избыточного бактериального роста (дисбактериоза);
• с клиническими и ультрасонографическими признаками гепатоза.

Микробиологическому анализу подвергали кал животных. Исследования проводились на 3 группах помесных пасюков. В первую опытную группу входили животные с симптомами синдрома избыточного бактериального роста (n=7), во вторую - с признаками гепатоза (n=3). Контролем служили клинически здоровые крысы (n=15).

 Работа проводилась на базе кафедры микробиологии и ветеринарно-санитарной экспертизы с основами стандартизации продуктов животноводства и НИИЦ КрасГАУ.

1 - на среде Кларка проводят реакцию Фогес-Проскауэра (для определения ацетилметилкарбинола) и реакцию с метилротом

2 - на 2%-й пептонной воде устанавливают наличие индолообразования с помощью реактива Эрлиха

3 - Лизиндекарбоксилазная среда

4 - Орнитиндекарбоксилазная среда

5 - наличие фенилаланиндезаминазы и триптофандезаминазы определяют наслоением на скошенную часть агара FeCl₃.

2.2 Методы исследований

Клиническое обследование животных включало в себя: термометрию, определения частоты дыхания, частоты сердечных сокращений, осмотра видимых слизистых оболочек и исследования лимфатических узлов.

Температуру тела у животных определяли в прямой кишке ртутным термометром. Пульс исследовали на бедренной артерии с внутренней поверхности бедра. Количество и глубину дыхательных движений определяли по числу вдохов и выдохов по движению грудной клетки и живота.

На ультрасонографии печени отмечали небольшое увеличение размеров, ровные контуры, диффузное повышение эхогенности. Структура паренхимы неоднородная, слабозернистая. В периферических отделах отмечали затухание эхосигналов и сосудистого рисунка.

Кал отбирали в стерильную емкость из прямой кишки.

После забора материал доставлялся в лабораторию, в течение двух часов. После доставки из него готовилось разведение 10^-1. Из первого разведения проводили дальнейшие разведения до 10^-10 и  посев на хлор-магниевую среду в количестве 1 мл для накопления патогенной микрофлоры.

Из разведений 10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5 и 10^-6 проводили посев на среды Плоскирева, Эндо, на 5%-й кровяной агар, азидную среду, среду Кандида и сывороточный БФ агар в количестве 0,05 мл с последующим растиранием шпателем. Из разведений 10^-5, 10^-6, 10^-7, 10^-8, 10^-9, 10^-10 производили посев в количестве 1 мл на Лактоагар глубинным методом. Из этих же разведений для определения бифидобактерий  проводили посев на гидрализатно-молочную среду в количестве 1 мл на дно пробирки, покрытой 2 см³ стерильным вазелиновым маслом.

Все питательные седы, подвергали инкубации: среды Плоскирева, Эндо, хлор-магниевую 24 ч при температуре 37^оС, среды Кандидо и сывороточный БФ агар при температуре 24^оС 5 дней, гидрализатно-молочную среду при температуре 37^оС 5 дней, лактоагар - при 37^оС 4 дня, 5%-й кровяной агар, азидную среду при температуре 37^оС 48 ч.

Для определения КОЕ производили подсчет числа выросших на средах колоний с общими культуральными свойствами. Число микроорганизмов данного вида в 1 г фекалий определяли по формуле, при посеве 0,05 мл разведения из материала:

M = N ∙ 20 ∙ 10ⁿ, где 

 М - число живых микробных клеток в 1 г фекалий;

N - количество колониеобразующих единиц;

20 - коэффициент;

10ⁿ - разведение, из которого выделен данный вид бактерий.

При внесении 1 мл из разведения материала формула приобретала вид:

M = N ∙ 10ⁿ, где  

М - число живых микробных клеток в 1 г фекалий;

N - количество колониеобразующих единиц;

10ⁿ - разведение, из которого выделен данный вид бактерий.

С культур, выросших на лактоагаре и гидролизатно-молочной среде, делались мазки со всех колоний и окрашивались по Граму, которые подвергались микроскопии.

С хлор-магниевой среды проводили посев петлей на висмут-сульфитный агар, который подвергали инкубации при температуре 37^оС 48 часов. При наличии роста на среде колоний типичных или атипичных для рода  Salmonella проводили типизацию.

Со сред отбирались колонии, схожие по культуральным свойствам, после чего каждой колонии присваивался номер и производился пересев на скошенный мясо-пептонный агар, который подвергался инкубации при температуре 37^оС 24 часа. Для исключения оксидазоположительной флоры проводили окси-тест.

Затем  был произведен пересев со скошенного мясо-пептонного агара на среды Олькеницкого, Гисса, Кларка, Козера, 2-%-ю пептонную воду, фенилаланинагар и триптофанагар, на орнитин- и лизиндекарбокслилазные среды для определения биохимических свойств микроорганизмов. Все среды подвергались инкубации, после которой проводили учет биохимической активности организмов.  

При учете биохимических реакций на средах Гисса, мы обращали внимание на изменение цвета среды (свидетельство сбраживания сахара до кислоты) и наличие разрывов среды (определение способности образовывать газ) (прил.2).

Для определения индолообразования, к бульонной культуре, выросшей в 2%-ой пептонной воде, приливали 2-3мл эфира, затем добавляли несколько капель реактива Эрлиха. В присутствии индола эфир окрашивался в розовый цвет (прил.3).

При учете биохимических реакций на лизин- и орнитиндекарбоксилозных средах обращали на изменение цвета и помутнение среды (прил.4).

На выросшую на фенилаланинагаре и триптофанагаре культуру вносили 4-5 капель 10%-го водного раствора FeCl₃ по скошенной части агара. При наличии в культуре фенилаланиндезаминазы образовывалась дорожка зеленого цвета, триптофандезаминазы - черного (прил.5).

Для постановки реакции на ацетилметилкарбинол (ацетоин), к четырехсуточной культуре, выросшей на среде Кларка, добавляли равный объем 6%-го раствора L-нафтола и 40%-го КОН. Через 4-6 часов инкубирования в термостате, при положительной реакции среда приобретала розовый цвет с желтым оттенком (прил.6).

Для реакции с метилротом, к четырехсуточной культуре, выросшей на среде Кларка, добавляют 3-5 капель метилового красного. В случае образования кислоты при ферментации глюкозы, среда окрашивалась в красный цвет. При слабом кислотообразовании цвет среды желтый (прил.6).

При учете биохимической реакции на среде Козера, обращали внимание на изменение цвета среды. Микроорганизмы, усваивающие цитрат, окрашивали среду в синий цвет (прил.7).

При учете реакций на среде Олькеницкого, мы так же отмечали изменение цвета разрывов среды. О ферментации лактозы (сахарозы) судят по изменению цвета среды в скошенной части, а о ферментации глюкозы - в столбике, в котором при газообразовании появляются пузырьки воздуха(разрывы среды или её отслоение от стенок пробирки). Образование сероводорода устанавливают по почернению среды. При росте культуры, гидролизующей мочевину, происходит щелочение, вследствие чего вся среда приобретает малиновый цвет. В случае указанного расщепления мочевины в среде Олькеницкого учет ферментации углеводов невозможен (прил.8).

Далее проводились биохимические тесты: определение β-галактозидазы, инозита, сорбита, малоната Na с помощью систем индикаторных бумажных для идентификации микроорганизмов (набор №2 для межродовой и видовой дифференциации энтеробактерий).

Полученные цифровые данные обработаны методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента [15] с использованием пакета «Статистика» MS EXCEL для персонального компьютера.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ  ИЗМЕНЕНИЯ МИКРОБИОЦЕНОЗА ПРЯМОЙ КИШКИ ПОМЕСНЫХ ПАСЮКОВ ПРИ  ЗАБОЛЕВАНИЯХ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА

Со времени открытия микроорганизмов постоянно возникал вопрос о роли и механизмах воздействия микрофлоры на организм человека. Воззрения на микрофлору менялись в зависимости от уровня ее познания.

 Кишечная микрофлора относительно устойчива к влиянию различных факторов внешней среды, но ее компенсаторные возможности небеспредельны. При появлении сильных или длительных неблагоприятных для ее существования условий, происходят нарушения ее состава, что мы и пытались обнаружить в наших исследованиях.

При исследовании кала помесных пасюков (далее пасюков), без видимых клинических патологических изменений, мы обнаружили следующих представителей микробного циноза прямой кишки: Escherichia coli, Serratia marcescens, бактерии таких родов как Klebsiella, Proteus, Citrobacter, Enterococcus, Staphylococcus, Enterobacter, Lactobacillus и Bifidobacterium. При патологических процессах, происходящих в организме, мы наблюдали тех же представителей, кроме того при дисбактериозе наблюдали появление представителя рода Proteus, вида Proteus vulgaris. Результаты проведенных исследований представлены в таблице (прил.1).

Далее мы детально рассмотрим изменения, происходящие при различных патологических процессах.

На рисунке 2.1 представлена динамика изменения количества Escherichia coli, так при дисбактериозе количество возрастало в 16,2 раза, тогда как при гепатозе - в 5,26 раза, по сравнению с контрольной группой.

Из гистограммы, приведенной на рисунке 2.2 видно, что у животных с признаками дисбактериоза количество Serratia marcescens увеличивается в 6,9 раз. В прямой кишке животных с симптомами гепатоза количесвто микроорганизмов данного вида увеличивается в 1,3 раза.

У животных с признаками синдрома избыточного бактериального роста наблюдалось увеличение общего количества бактерий рода Klebsiella в 54,34 раза (Klebsiella aranae - в 76,99; Klebsiella pneumonia - в 15,23; Klebsiella rhinoschleromatis - в 71, 65). В группе животных с симптомами гепатоза общее количество микроорганизмов данного рода так же увеличивалось (в 410,86 раз), но количество Klebsiella pneumonia уменьшалось в 1,46 раз

При дисбактериозах и гепатозах происходило увеличение общего  числа микроорганизмов рода Proteus в 10,88 и 10,41 раз соответственно (Proteus mirabilis -  в 4,4*10² и 0,7*10² раз,  Proteus rettgeri -  в 19,6 и 1,84 раз,   количество Proteus vulgaris при дисбактериозах возрастает в 1,45 раз, при гепатозах не обнаружен).

Бактерии рода Citrobacter увеличивали свое общее количество в 1,6*10⁴ раза при дисбактериозах и в 0,007*10² при гепатозах.

В группе животных с признаками синдрома избыточного бактериального роста наблюдалось резкое увеличение количества микроорганизмов рода Enterococcus - в 5,3*10⁵  раз. При гепатозах число микроорганизмов этого рода возрастало в 1,05 раз, причем количество Enterococcus faecalis наоборот, уменьшаелось в 2,36 раза.

Staphylococcus epidermidis увеличивал свое содержание в 41,86 раз при дисбактериозах и в 1,6 раз при гепатозах.

Количество Enterobacter aerogenes возрастало в 6,8 при дисбактериозе и в 1,04 раза при гепатозе.

Одновременно с увеличением числа потенциально-патогенных микроорганизмов происходило уменьшение количества анаэробной нормофлоры. Содержание лактофлоры при дисбактериозах снижалось в 705, 12 раз, при гепатозах - 2,84 раза.

У животных с признаками синдрома избыточного бактериального роста наблюдалось снижение количества бифидобактерий - в 4,7*10³, в группе крыс с признаками гепатоза - в  7,6*10².

Так как, мукозный слой кишечника, по существу, является биореактором, где идет образование метана, следовательно, работают архибактерии-метаногены, эффективность которых строго зависима от концентрации водорода в систиме. В метаногенном сообществе водородные бактерии играют ключевую регуляторную роль благодаря обратной связи процесса продукции и потребления водорода на первичный процесс расщепления углеводов с образованием ацетата.

Таким образом, при синдроме избыточного бактериального роста происходит изменение численности метаногенных бактерий, что приводит к изменению концентрации газов (Н₂, СН₄ и др.) в системе и накоплению их в полости кишечника. Это в свою очередь вызывает смещение окислительно-восстановительного потенциала внутрипросветной среды в сторону резкоотрицательных значений, при которых блокируются ферредоксинсодержащие ферменты, обеспечивающие жизнедеятельность облигатных анаэробов [5, 24,57].

Выявленные нами изменения флоры при гепатозе, можно объяснить нарушением оттока желчи, застойными процессами, которые создают благоприятные условия для развития потенциально-патогенных бактерий. Как следствие имеет место развитие синдрома избыточного бактериального роста, при котором происходят изменения микробного пейзажа пищеварительного тракта, описанные выше.

ВЫВОДЫ

• 1. В прямой кишке крыс с признаками синдрома избыточного бактериального роста и с симптомами гепатоза происходит резкое увеличение числа потенциально-патогенных микроорганизмов, таких как Proteus spp., Staphylococcus epidermidis , Klebsiella spp..
• 2. Гепатоз и бактериоз у помесных пасюков приводит к резкому снижению в прямой кишке количества анаэробной нормофлоры.

ПРЕДЛОЖЕНИЕ

Результаты нашей работы могут быть использованы для обучения студентов по дисциплине «Ветеринарная микробиология», а так же практикующими ветеринарными врачами при лечении мелких и экзотических домашних животных.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

• 1.  Ардатская М. Д., Минушкин О. Н. Современные принципы диагностики и фармакологической коррекции // Гастроэнтерология, приложение к журналу Consilium Medicum. - 2006. - Т. 8. - №2.
• 2. Ардатская М.Д. Клиническое значение короткоцепочечных жирных кислот при патологии желудочно-кишечного тракта. Дис. ... д-ра мед. наук. М., 2003.
• 3. Ардатская М.Д., Минушкин О.Н., Бабин В. Н. и др. Определение содержания и профиля низкомолекулярных метаболитов в кале у пульмонологических больных до и после проведения антибактериальной терапии. Факты и размышления. Клин. вестн. ПМЦ РФ. 1995; 3: 13-4.
• 4. Ардатская М.Д., Минушкин О.Н., Елизаветина Г.А., Зверков И.В. Клинические возможности использования метаболитов кишечной микрофлоры в диагностике и тактике лечения больных с синдромом раздраженного кишечника. Материалы 29-й конференции "Функциональные заболевания и расстройства функций. Гастроэнтерологическая онкология". Смоленск, 2001; с. 3-11.
• 5. Ардатская М.Д., Минушкин О.Н., Масловский Л.В., Сергеев А.В. Короткоцепочечные жирные кислоты и внешнесекреторная недостаточность поджелудочной железы у больных с хроническим панкреатитом. Материалы 31-й конференции "Негативные эффекты лечения. Сочетанные болезни органов пищеварения и отягощение их другой патологией; различные аспекты диагностики и лечения в гастроэнтерологиию". Смоленск, 2003; с. 209-15.
• 6. Ардатская М.Д., Минушкин О.Н., Прихно Н.И., Дубинин А.В. Летучие жирные кислоты и их диагностическое и прогностическое значение в гастроэнтерологической клинике. Рос. журн. гастроэнтер., гепатол. и колопроктол. 2000; X (5): 63-70.
• 7. Бабин В.Н., Домарадский И.В., Дубинин А.В., Кондракова О.А. Биохимические и молекулярные аспекты симбиоза человека и его микрофлоры. Росс. хим. журн. (ЖРХО им. Менделеева), 1994; 38 (6): 66-78.
• 8. Бабин В.Н, Минушкин О.Н., Дубинин А.В и др. Молекулярные аспекты симбиоза в системе хозяин-микрофлора. Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. 1998; 6: 76-82.
• 9. Белоусова, Е.А. Синдром избыточного бактериального роста в тонкой кишке в свете общей концепции о дисбактериозе кишечника: взгляд на проблему - Фарматека, №2, 2009, 8 - 16.
• 10. Василенко В.В. Дисбактериоз - синдром раздраженного кишечника: эссе-анализ проблемы. Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. 2000; 6: 10-3.
• 11. Дубинин А.В., Бабин В.Н., Раевский П.М. Трофические и регуляторные связи макроорганизма и микрофлоры. Клин. мед. 1991; 7: 24-8.
• 12. Корнеев, М.Л., Воробьев, А.А., Миронов, А.Ю., Лыкина Е.В. Штаммовая общность пристеночного муцина желудочно-кишечного тракта биологической модели - Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье», №2, 2006.
• 13. Красноголовец В.Н. Дисбактериоз кишечника. М.: Медицина, 1989.
• 14. Куваева И.Б., Ладодо К.С. Микроэкологические и иммунные нарушения у детей. М.: Медицина, 1991.
• 15. Лакин, Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин - М.: Высшая школа, 1990. - 352 с.
• 16. Минушкин О.Н., Ардатская М.Д., Бабин В.Н., Дубинин А.В. Исследование короткоцепочечных жирных кислот в кале при сочетанной патологии толстой кишки и легких. Материалы научно-практической конференции "Сочетанные гастроэнтерологические заболевания. Взаимосвязанные поражения органов ротовой полости и органов пищеварения". Смоленск, 1999; с. 226-31.
• 17. Минушкин О.Н., Ардатская М.Д., Бабин В.Н. и др. Дисбактериоз кишечника. Рос. мед. журн. 1999; 3: 40-5.
• 18. Минушкин О.Н., Ардатская М.Д., Масловский Л.В. Роль кишечной микрофлоры в патогенезе желчнокаменной болезни (по результатам изучения короткоцепочечных жирных кислот в кале). Материалы 29-й конференциижирных кислот в кале). Материалы 29-й конференции "Функциональные заболевания и расстройства функций. Гастроэнтерологическая онкология". Смоленск, 2001; с. 77-83.
• 19. Минушкин О.Н., Минаев В.И. (ред.), Митрохин С.Д., Ардатская М.Д. и др. (составители). Комплексная диагностика, лечение и профилактика дисбактериоза (дисбиоза) кишечника в клинике внутренних болезней МЦ УД ПРФ (методические рекомендации). М., 1997.
• 20. Панышева, Л.Д. Болезни норок, связанные с нарушением обмена жиров и липидов (обзор иностранной литературы) - «Кролиководство и звероводство№, 1963, №10.
• 21. Парфенов А.И. Клинические проблемы дисбактериоза. Рос. гастроэнтерол. журн. 1999; 4: 49-55.
• 22. Перельдик, Н.Ш. Алиментарное жировое перерождение печени у норок - В кн.: «Болезни пушных зверей», М.: - Сельхозгиз, 1952.
• 23. Прихно Н.И., Минушкин О.Н., Ардатская М.Д. и др. Изучение состава короткоцепочочных жирных кислот в фекалиях и сыворотке периферической крови у пациентов, страдающих желчекаменной болезнью и значения КЖК для изучаемого заболевания. Клин. мед. 2001; 4: 37-40.
• 24. Тец В.В. Справочник по клинической микробиологии. СПр., 1994.
• 25. Данилевская, Н.В., Субботин, В.В. Лекарственные дисбактериозы: причины и последствия - Ветеринар, №1, 2003.
• 26. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. М., 1998.
• 27. Шептулин А.А. Синдром избыточного бактериального роста бактерий и "дисбактериоз кишечника": их место в современной гастроэнтерологии. Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. 1999; 3: 51-4.
• 28. Bai JC. Malabsorption Syndromes. J Digestion 1998; 59: 530-46.
• 29. Berg RD. Bacterial translocation. In Blum HE, Bode JC, Bode C, Sartor RB. (eds.) Gut and Liver. Proceeding of the Falk Symposium 100. Kluwer Academic Publishers. 1998; p. 47-60.
• 30. Berg R.D. Bacterial translocation from the gastrointestinal tract. Trends Microbiol 1995; 3: 149-54.
• 31. Casafont F, Martin L, Pons-Romero F. Bacterial overgrowth in the small intestine in chronic liver disease. Proceeding of the Falk Symposium 100. Kluwer Academic Publishers. 1998; p. 332-40.
• 32. Gibson GR, Macfarlane GT (edit.) Human colonic bacteria: role in nutrition, physiology and pathology. CRC Press 1995; p. 1-18.
• 33. Hentges DJ. Human intestinal microflora in health and disease. New York: Academic Press, 1983.
• 34. Macfarlane GT, Macfarlane S. Human colonic microbiota: ecology, physiology and metabolic potential of intestinal bacteria. Scand J Gastroenterol 1997; 32 (Suppl. 222): 3-9.
• 35. Ozcelic MF, Pekmezci S, Altinli E et al. Lactulose to prevent bacterial translocation in biliary obstruction. Dig Surg 1997; 14: 267-71.
• 36. Parks RW, Clements WD, Pope C, Halliday MI et al. Bacterial translocation and gut microflora in obstructive jaundice. J Anat 1996; 189: 561-5.
• 37. Salminen S, Isolauri E, Onela T. Gut flora in normal and disordered states. Chemotherapy 1995; 41 (Suppl. 1): 5-15.
• 38. Salyers AA. Bacteroides of the human lower intestianal tract. Ann Rev Microbiol 1984; 38: 293-313.
• 39. Sartor RB, Lichtman SN. Hepatic injury and biliary tract diseases associated with small intestinal bacterial overgrowth. Proceeding of the Falk Symposium 100. Kluwer Academic Publishers. 1998; pp. 241-50.
• 40. Sedman PC, Macfie J, Sagar P et al. The prevalence of gut translocation in humans. Gastroenterology 1994; 107: 643-9.
• 41. Tannock GW. Normal microflora. London: Chapman & Hall, 1995.