IV Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2012

В современном мире на фоне научно-технического прогресса  наблюдается интенсивное антропогенное воздействие на окружающую среду. За последние 25 лет в результате выброса в атмосферу промышленных загрязнений и уменьшения толщины озонового слоя произошло существенное повышение интенсивности ультрафиолетового (УФ) излучения, в особенности его коротковолнового спектра [14]. В  связи с этим резко возрастает роль УФ-излучения как фактора, дестабилизирующего устойчивость живых систем.

Известно, что воздействие оптического излучения на биологический объект вызывает фотобиологические процессы, начинающиеся с поглощения фотона тканями организма и заканчивающиеся фотобиологическими реакциями на уровне молекул, которые таким образом, приобретая дополнительную энергию, возбуждаются. Возбужденные же биомолекулы могут участвовать в фотохимических реакциях (ионизации, окисления и восстановления, изомеризации, димеризации, диссоциации). Результатом этого являются структурно-функциональные изменения молекул, носящие, как правило, деструктивный характер [5].

УФ-излучение делится на три основных диапазона: УФ-А (315-400 нм), УФ-В (280-315 нм) и УФ-С (100-280 нм). При воздействии на живые организмы наиболее активна ультрафиолетовая область с длинами волн менее 315 нм [6]. Ультрафиолет ускоряет процессы старения в организме (в особенности, кожных покровов) [1] и по мнению многих авторов [6, 13] является мощным прооксидантным фактором. Образующиеся таким образом свободные радикалы являются важным признаком развития многих патологических состояний и угнетения основных жизненных функций. Усиление же свободнорадикального окисления ведет к ответной реакции ферментных систем, в первую очередь, антиоксидантной, которая принимает непосредственное участие в молекулярных механизмах неспецифической резистентности организма к повреждающим факторам внешней среды [2].

Целью данной работы явилось изучение ранних изменений в активности ферментов при жёстком УФ-облучении, предшествующих нарушению функциональных и морфологических показателей органов и тканей.

Материал и методы исследования. Исследование проводилось на белых беспородных мышах инбредной линии с соблюдением правил гуманного отношения с животными. Было отобрано две группы мышей: контрольная и опытная (n=6 в каждой группе). Все особи являлись самцами приблизительно одного возраста, массой 25-28 г.

В качестве источника ультрафиолетового излучения использовался ртутно-кварцевый облучатель мощностью 125 Вт с эффективным спектром в области 220-400 нм, т.е. включающий УФ всех трёх диапазонов. Облучение проводилось по 3 минуты ежедневно в течение 14 дней. На 15-й день производился забор крови и внутренних органов путем полного обескровливания животных (декапитация).

Сыворотка крови исследовалась на активность аланинаминотрансферазы (ALT; КФ 2.6.1.2) и холинэстеразы (ХЭ; КФ 3.1.1.8). Сыворотку отделяли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 3 мин. Определение данных ферментов выполняли спектрофотометрическим методом с помощью автоматического биохимического анализатора «Microlab 300». Для работы на анализаторе использовали стандартные наборы реактивов производства ЗАО «ЛАХЕМА ИНТЕРНЭШНЛ». Сыворотка крови и реагенты предварительно инкубировались при 37^оС.

Активность ALT определяли по реакции переаминирования между L-аланином и α-кетоглутаратом с образованием пирувата и L-глутамата. Пируват в свою очередь восстанавливается НАДН до лактата под действием лактатдегидрогеназы. Активность ALT в пробе пропорциональна скорости окисления НАДН до НАД и уменьшению поглощения при 340 нм [9].

Активность ХЭ определялась по реакции гидролиза бутирилтиохолина до бутирата и тиохолина. Тиохолин восстанавливает гексациано-(III+)-феррат калия до бесцветного гексациано-(II+)-феррата калия. Изменение поглощения при 405 нм пропорционально активности холинэстеразы в образце [12].

Внутренние органы изучались на активность ферментов антиоксидантной защиты организма. Для этого были выбраны каталаза (КАТ; КФ 1.11.1.6) печени и супероксиддисмутаза (СОД; КФ 1.15.1.1)  селезёнки. Для определения КАТ печени и СОД селезёнки данные органы подвергались гомогенизации в фосфатном буфере (рН 7,8 и 7,4 соответственно) и центрифугированию при 3000 об/мин в течение 10 мин. Активность КАТ и СОД исследовалась в супернатантной фракции спектрофотометрическим методом на спектрофотометре «UNICO модель 2800».

Активность каталазы печени проводили согласно методике [4] по скорости убыли перекиси водорода в среде инкубации; концентрация перекиси водорода оценивалась по реакции с молибдатом аммония, образующего стойкий окрашенный комплекс.  Интенсивность развившейся окраски определяли при 410 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см.

Супероксиддисмутазная активность селезёнки определялась по методу, основанному на способности СОД ингибировать реакцию аутоокисления адреналина в щелочной среде [7]. При расчёте удельной активности СОД учитывается количество биологического материала, для чего измеряется оптическая плотность пробы при 280 нм; расчёт проводится на 0,1 ед. опт. плотности при данной длине волны.

Полученные результаты, представленные в Таблице 1  обрабатывались статистически с использованием t-критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение. Было установлено, что активность ALT сыворотки крови снижена примерно на 30% у мышей, подвергавшихся УФ-облучению. Активность данного фермента повышается при нарушении работы печени (изменение проницаемости мембран), где этот фермент образуется, однако наблюдаемое снижение его активности говорит о том, что печень опытных мышей могла претерпеть определённые деструктивные нарушения [3].

Таблица 1. Биохимические показатели мышей при УФ-облучении

Биохимические показатели	Группа животных
	Контроль (n=6)	УФ-облучение (n=6)
ALT сыворотки, Е/л	81,2±20,0	56,6±14,8
ХЭ сыворотки, Е/л	5891,3±1095,2	7974,0±2157,5
КАТ печени, мкат/л	70,5±18,6	56,5±14,9
СОД селезёнки, усл. ед.	3,93±0,85	5,16±1,43

Активность ХЭ сыворотки крови в опыте повышена на 35%, что  увеличивает защитные возможности организма к стрессовому воздействию [8]. Это также может коррелировать с общим повышением активности обменных процессов при облучении и рассматриваться как адаптация.

Показано, что воздействие жёсткого ультрафиолетового излучения приводит к изменению активностей антиокислительных ферментов СОД и КАТ, что связано с повышенным образованием активных форм кислорода и активацией перекисного окисления липидов. Установлено, что СОД селезёнки в опытной группе была повышена на 31% по сравнению с контролем. Однако каталазная активность печени в опыте снижена в среднем на 20%. Повышение активности СОД является адаптивной реакцией организма, направленной на обезвреживание активных форм кислорода, в первую очередь супероксидных анион-радикалов [10].

Снижение каталазной активности печени коррелирует со снижением ALT сыворотки крови. Так как оба фермента образуются в печени, это указывает на снижение синтетической функции данного органа и некоторое истощение его ресурсов в защите организма от вредного внешнего фактора. В данном случае возможно явление перекрёстной регуляции активности КАТ и СОД, когда снижение активности одного фермента компенсируется повышением активности другого, также обладающего антиокислительной способностью [11].

Суммируя вышесказанное можно сделать вывод, что УФ-облучение на протяжении 14 дней провоцирует определённую ответную реакцию на уровне изменений в активности ферментов и приводит к некоторому истощению резервных возможностей организма, что может стать первопричиной различных морфологических и функциональных сдвигов.

Таким образом, показано комплексное воздействие ультрафиолетового излучения диапазонов А, В и С на некоторые ферменные системы теплокровного организма. Полученные данные имеют важный практический интерес в разработке методов стабилизации свободнорадикального окисления липидов мембран и коррекции других обменных процессов. Это в свою очередь позволяет повысить адаптационные возможности животных и человека, разработать методы лечения различных патологических состояний и замедлить преждевременное старение.

Литература

• 1. Гичев, Ю. П. Экологические аспекты медицины / под ред. Ю. П. Гичева. - Новосибирск: СО РАМН, 2000. - Т. 2. - 239 с.
• 2. Зенков, Н. К. Окислительный стресс. Биохимический и патофизиологический аспекты / Н. К. Зенков, В. З. Лакин, Е. Б. Меньшиков. - М. : Наука / Интерпериодика, 2001. - 340 с.
• 3. Клиническая биохимия: учеб. пособие / А. Я. Цыганенко [и др.]. - М. : Триада-X, 2002. - 504 с.
• 4. Метод определения активности каталазы / М. А. Королюк [и др.] // Лабораторное дело. - 1988. - № 1. - С. 16-19.
• 5. Механизмы влияния облученной ультрафиолетовыми лучами крови на организм человека и животных: Сб. науч. тр./ Под ред. И. Е. Ганелиной, К. А. Самойловой. - Л. : Наука, 1986. - 264 с.
• 6. Потапенко, А. Я. Действие света на человека и животных / А. Я. Потапенко // Соросов. образов. журн. - 1996. - № 10. - С. 13-21.
• 7. Сирота, Т. В. Новый подход в исследовании процесса аутоокисления адреналина и использование его для измерения активности супероксиддисмутазы / Т. В. Сирота // Вопр. мед. химии. - 1999. - Т. 45, Вып. 3. - С. 263-272.
• 8. Старостина, В. К. Холинэстераза: методы анализа и диагностическое значение: информационно-методическое пособие / В. К. Старостина, С. А. Дегтева. - Новосибирск : Вектор-Бест, 2008. - 35 с.
• 9. A simple procedure for routine determination of aspartate aminotransferase and alanine aminotransferase with pyridoxal phosphate / F. J. Gella [et al.] // Clin Chim Acta. - 1985. - Vol. 153. - P. 241-247.
• 10. Gregogy, E. M. Superoxide dismutase and oxygen toxicity in a eykaryote / E. M. Gregogy, S. A. Goscin, I. Fridovich // J. of Bacteriol. - 1974. - Vol. 117, № 2. - P. 456-460.
• 11. Marklund, S. L. Properties of extracellular superoxide dismutase from human lung / S. L. Marklund // Biochem. J. - 1984.- Vol. 220. - P. 269-272.
• 12. Proposal of Standard Methods for the Determination of Enzyme Catalytic Concentrations in Serum and Plasma at 37°C II. Cholinesterase (acylcholine acylhydrolase, EC 3.1.1.8) / E. Schmidt [et al.] // Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. - 1992. - Vol. 30. - P. 163-170.
• 13. Punnonen, K. Effects of ultraviolet A and B irradiation on lipid peroxidation and activity of the antioxidant enzymes in keratinocytes in culture / К. Punnonen, A. Puntela, M. Ahotupa // Photochem. Photoimmunol. Photomed. - 1991. - № 2. - Р. 3-6.
• 14. Van der Leun, J. C. Photobiology and the ozone layer / J. C. Van der Leun // J. Photochem. Photobiol. B: Biol. - 1998. - Vol. 44, № 3. - P. 165.

Код для цитирования: Скопировать