IV Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2012

Лягушка травяная (RANA TEMPORARIA, ANURA, AMPHIBIA) объект, который на протяжении многих лет используется в различных областях биологии. Прежде всего, это связано с относительной простотой содержания и неприхотливостью животных. Помимо этого лягушка может быть прекрасным объектом дня наблюдения за формированием, развитием и закладкой различных систем, что связано с уникальным циклом развития земноводных.  Преимущество исследования эмбрионального развития земноводных по сравнению с другими позвоночными (млекопитающими, птицами) в том, что есть возможность исследовать развитие не только путем изучения постоянных эмбриологических препаратов, но и непосредственно визуально оценивать особенности развития. Так же эта особенность позволяет и частично проводить оценку влияния различных тератогенных факторов на развитие и закладку систем, причем, давая возможность следить за дальнейшим развитием, жизнью уже взрослой особи и возможным потомством. Так же следует отметить то, что в эмбриогенезе травяной лягушки существует четко сформированная система постадийного развития ротового и опорно-двигательного аппарата. Отклонения то этой системы является наиболее наглядным проявлением влияния различных тератогенов на эмбриогенез амфибии. Закладка опорно-двигательного аппарата - важная часть онтогенеза. В сущности, процесс этот сложный и многоэтапный и во многом еще не изучен. Помимо этого он определяет развитие, функционирование организма и его дальнейшую способность к выживанию. Процесс закладки скелета скоординирован и имеет специфическую последовательность стадий. Любые отклонения могут привести к неправильному развитию и функционированию организма. Стоит отметить, что помимо закладки непосредственно хрящевых элементов скелета в эмбриогенезе немаловажны ход и время наступления оссификации.

Поскольку существование большинства позвоночных связано, прежде всего, с активным добыванием пищи, то правильное формирование пояса конечностей  и непосредственно конечностей играет ключевую роль в выживание особи и вида в целом.

Именно поэтому, целью нашей работы стало изучение анатомо-гистологического строения пояса конечностей и свободных конечностей в эмбриогенезе личинки лягушки травяной.

Для реализации данной цели были поставлены задачи:

Определить стадии развития головастиков по строению рта и конечностей.

Проанализировать развитие головастиков лягушки травяной на разных стадиях развития.

 Выявить возможные  аномалии в развитии головастиков.

Передние и задние конечности появляются одновременно, задние конечности хорошо заметны сразу, а передние находятся под жаберными крышками - складками кожи по бокам головы. Через месяц после появления на свет головастика в его конечностях образуются суставы.

На стадиях, предшествующих формированию видимой почки конечности амфибий, доказана «ведущая роль» мезенхимы, ее индуцирующее влияние на прилегающий эпидермис.

Внешне морфологическая картина роста и развития почки задней конечности такова. По мере удлинения почки дистальная часть ее оказывается более плоской и более широкой. На этой стадии «лопатки», или «пластинки», длина всего зачатка превышает его ширину. Края лопатки становятся неровными: определяются не- большие выросты - зачатки пальцев, которые продолжают расти, а в промежутках между ними заметного роста не наблюдается. У амфибий сначала появляются первые два пальца, а затем последовательно появляются зачатки 3-го, 4-го и 5-го пальцев. Осcификация происходит не равномерно. Очаги охрящевения впоследствии объединяются в единый скелетный комплекс. Проксимальные части костного скелета закладываются, в общем, ранее, чем дистальные.

Исследования проводились методом лабораторной обработки. Выборка носит случайный характер. Объем выборки составил 127 особей.

Фиксированный материал находился в растворе 10%-го формалина. Производился осмотр внешнего строения (жаберной крышки, жабр - если они есть, ротового аппарата, конечностей) исследуемого материала, в ходе которого были определены стадии развития головастиков. Для определения стадий использовали таблицу из книги Астаурова, Детлафа «Объекты биологии развития»[1,c.452]. Для стадий 37-48 диагностическими признаками являются строение рта и конечностей.

Приготовление препаратов производилось стандартным методом. По окончании фиксации из материала удалялась фиксирующей жидкости в проточной воде в течение 24-48 часов. Для обезвоживания и уплотнения исследуемого материала использовали батарею спиртов повышающей концентрации (70%, 80% и 96%). Потом материал выдерживали в двух порциях чистого ксилола по полчаса, а затем в смеси парафина с ксилолом. Заливали материал парафином. Затем «приклеивали» на деревянный кубик.  Для изготовления срезов деревянный кубик закрепляли в блокодержатель микротома. Получаемые срезы помещали на предметное стекло. Затем срезы окрашивались гематоксилин-эозином. После окрашивания срезы рассматривались под микроскопом и фотографировались.  

Также была проведена окраска  альциановым синим и ализариновым красным: промытый материал выдерживался в альциановом синем 1 сутки и столько же в 100% этаноле, после чего окрашивался ализариновым красным 1 сутки и обесцвечивался в батарее смесей КОН+глицерин.

Помимо этого, часть живого материала (30 особей) развивалось в растворе кадмия в течение 3-х недель при концентрации 0,5 мг/л, что не превышает нормы ПДК.

Были сделаны три вида замеров головастиков: длина тела (от начала головы до хвоста), длина хвоста, общая длина тела (от начала головы до кончика хвоста).

В результате визуального осмотра личинок по диагностическим признакам были обнаружены головастики 37, 39, 41-48 стадии развития.  В строение ротового аппарата примечательно различие в количестве рядов зубчиков на разных стадиях. Так,  для 39 стадии характерно наличие на верхней губе одного непрерывного ряда зубчиков, на нижней  - одного прерывистого и двух непрерывистых. На 41 и 42 стадиях верхняя губа имеет 1 непрерывный ряд зубчиков и 1 прерывистый, а нижняя губа-1 прерывистый и 2 непрерывных. 43 стадия характеризуется наличием на верхней губе одного непрерывного и двух прерывных рядов зубчиков, а на нижней губе - 3 непрерывных рядов.  Начиная с 44 стадии ротовой аппарат перестает изменятся и представляет собой следующее: верхняя губа -1 непрерывный и 2 прерывистых ряда зубчиков, нижняя- 4 непрерывных ряда. Задние же конечности, напротив, после 44 стадии разительно преобразуются при переходе от стадии к стадии. Если с 39 по 43 стадии зачатки задних конечностей представляют из себя небольшие слабо оформленные выросты, то на 44 стадии уже можно отчетливо различить зачатки трех пальцев, на 45 и 46- зачатки всех 5 пальцев, а на 47-48 стадиях - оформленный голеностопный сустав и межпальцевую перепонку.

Кроме того, было обнаружено 8 личинок,  которых по диагностическим признакам ротового аппарата можно отнести к 44 стадии, а по развитию конечностей к 43. Различия эти являются вариантами нормы, так как патологической считается разница более чем в 3 стадии.

По литературным данным закладка почки верхней конечности происходит на 36 стадии, представлена мезенхимальными и эпителиальными клетками. [2,3,4] К 39 стадии на микросрезах различимы пояс передних конечностей -лопатка и надлопатка, кости свободной конечности и образованные ими плечевой, локтевой и сустав кисти. На 44 стадии при окраске альциановым синим различимы контуры плечевой и локтевой кости - светло-голубой цвет.  На 46-47 наступает деструкция  хрящей конечности в области диафиза костей плеча и предплечья, что даёт более глубокий голубой цвет в данных участках, фаланги пальцев дают светло-голубую окраску. На 49 стадии проявляется действие ализаринового красного,  в виде фиолетового окрашивания диафизов костей плеча и предплечья, что может свидетельствовать о начале оссификации; остальные части передней конечности остаются на стадии зрелого хряща,  на что указывает их глубокий голубой цвет.

Зачатки задних конечностей становятся отчетливо различимы уже на 39-40 стадиях. Однако начальные процессы закладки костей бедра и голени при окраске альциановым синим мы наблюдаем только на 44-45 стадиях. Окрашивание светло синим обосабливающихся зачатков пальцев  на 46 стадия свидетельствует о начале формирования хрящевых структур стопы. На 47 стадии можно отменить участки хряща с более интенсивным окрашиванием, а именно: первые фаланги 3,4 и 5 пальцев, диафиз костей проксимального ряда предплюсны, кости голени и бедра . Как и на передних конечностях действие ализаринового красного было отмечено только на 49 стадии. К этому времени закладка хрящей полностью завершилась и наблюдается начало замещения его на костные структуры, окрасившиеся фиолетовым. Этот процесс наиболее заметен на бедренной и подвздошных костях, причем если у бедренной кости изменения происходят в центральной части, то у подвздошной кости интенсивное окостенение наблюдается в непосредственной близости от вертлужной впадины.

Исследование микропрепаратов  позволило определить основные этапы закладки позвоночного столба у личинок лягушки.  Обнаружены центры охрящевения и оссификации - стартовые точки располагались в дугах позвонков, позднее появлялись в телах. Молодой хрящ был различим уже на 40 стадии, зрелый хрящ - на 42. Процесс деструкции хряща продолжался с 41 по 48 стадии.

На основании измерений  личинок и расчета средней арифметической мы смогли судить о том, что увеличение длинны тела, хвоста и общей длинны тела с 37 по 48 стадии происходит равномерно, не наблюдается  как резких ускорений роста, так и задержек в развитии.

Также была проведена статистическая обработка методом гистограмм по Бруксу и Краузерсу. Преобладающее число особей в нашей выборке имели размер общий размер тела лежащий в диапазоне от 26,4 до 31,2. Таким образом, преобладают особи с максимальными значениями длины тела, хвоста и общей длины тела. Это можно объяснить преобладанием более поздних стадий в выборке.

Небольшие дозы кадмия (0,5 мг/л) существенно отразились на выживаемости исследуемой выборки, большая часть головастиков погибла не достигнув 40-х стадий развития. Выжившие особи демонстрировали не естественную пассивность (опускались на дно) или активность (хаотичные рывки). В работах М.В. Егоровой, Н.П. Афанасьева (2010-2011г.) упоминаются аналогичные формы поведения, а также остановка роста, уменьшение размеров задних конечностей (в среднем на 20%), а также торможение прочесов элиминации хвоста, что свидетельствует о продление личиночной стадии развития.

Таким образом  изученные головастики, по диагностическим признакам относятся к 37-48 стадиям, выявлено преобладание особей с максимальными значениями длины тела, хвоста и общей длины тела(методом гистограмм по Бруксу и Краузерсу). Отклонений от нормы в развитии личинок Rana temporaria, выращенных в водной среде без кадмия не наблюдалось. В водной среде с ионами кадмия наблюдали только остановку в развитии и гибель особей.

Список литературы:

1.  Астауров Б.Л., Детлаф Т.А. Объекты биологии развития. М.: Наука, 1975 г. - 579с.

2. Вопросы герпетологии. Научное издание. Материалы 3 съезда герпетологического общества А.М. Никольского. СПбГУ, Санкт-Петербург, 2008.

3. Дмитриева Е.В. Влияние плотности икры на темпы развития и смертности серой жабы в лабораторных условиях // Зоологический журнал, 2007, февраль, Т.86, №2, с.229.

4. Балеева Н.В. Грудной пояс амфибий. - СПб.: Изд-во СПбГУ, 2009.  -  151с.

Код для цитирования: Скопировать