IV Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2012

Микоплазмоз - заболевание, вызываемое видами Mycoplasma. Два из них - Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis - являются возбудителями мочеполового микоплазмоза, который в настоящее время занимает значительное место среди заболеваний, передающихся половым путем /1/.

Диагностика микоплазмоза достаточно сложна - признаков, характерных только для этого заболевания, нет, а сами микоплазмы настолько малы, что их невозможно обнаружить при обычной микроскопии. /2/

Носителями Mycoplasma hominis являются 20-50% женщин. У мужчин они встречаются реже. У мужчин возможно самоизлечение. Mycoplasma genitalium распространены значительно меньше, чем Mycoplasma hominis /3/.

В настоящее время диагностика микоплазмоза, вызываемого видами M. hominis  и M. genitalium может осуществляться различными методами. Традиционным является метод иммуноферментного анализа, основанный на высокой избирательности и специфичности иммунологических реакций "антиген-антитело", однако точность данного метода составляет 80-86%, что позволяет определить его как вспомогательный способ диагностирования микоплазмоза /4/. Культуральный метод, позволяющий определить количественное соотношение возбудителей микоплазмоза, а также их чувствительность к наиболее широко используемым лекарственным препаратам, может использоваться только в отношении M. hominis, т.к.  M. genitalium не растут на питательных средах /5/.

Наиболее современным и достоверным (точность диагностики составляет 99%) методом диагностики микоплазмозов является метод полимеразной цепной реакции, основанный на выявлении генетического материала возбудителя (ДНК) в биологическом материале /6/. Метод обладает рядом преимуществ. Среди них:

• высокая чувствительность и специфичность метода, что дает возможность выявления персистирующих, некультивируемых форм микоплазм;
• выявление генетического материала в малом количестве пробы;
• скорость проведения исследования - быстрое получение результата;
• возможность использования разных видов биологического материала в зависимости от места предполагаемой локализации возбудителя /7/.

Пробой для ПЦР-диагностики микоплазмы может быть соскоб эпительных клеток и отделяемое урогенитального тракта, секрет простаты, мокрота, синовиальная жидкость, моча и др. /8/.

Целью настоящего исследования было изучение распространенности видов M. hominis  и M. genitalium в Карагандинской области методом ПЦР.

Материалы и методы

Для выявления двух видов микоплазм M. hominis и M. genitalium, вызывающих заболевания, передающиеся половым путем, изучали образцы ДНК, выделенные из биологического материала 1383 пациентов мужского и женского пола в возрасте от 20 до 73 лет (Рис. 1).

Из рисунка видно, что количество анализов на наличие M. hominis и M. genitalium значительно больше у мужчин (66,6 %) нежели у женщин (33,4 %), но при этом количество положительных результатов у пациенток женского пола (16,5 %) практически в два раза превышают таковые у пациентов мужского пола (8,9 %). Полученные результаты согласуются с литературными данными, свидетельствующими, что возбудители микоплазмоза чаще встречаются у женщин /3/.

Материалом для исследования являлись мазки и соскобы из цервикального канала, уретры, влагалища, сок простаты, сперма. Молекулы ДНК выделяли, используя набор реагентов «ДНК-сорб-АМ». Реакцию амплификации проводили с использованием тест-системы фирмы «АмплиСенс» в  амплификаторе «Терцик МС - 2». Детекцию продуктов амплификации проводили во флуоресцентном анализаторе «ALA-1/4».

Результаты и обсуждение

С целью выявления микоплазмоза у пациентов выделяли ДНК из биологического материала с использованием набор реагентов «ДНК-сорб-АМ». С выделенными образцами ДНК ставили реакции амплиифкации с применением тест-систем «АмплиСенс Mycoplasma hominis-FL», «АмплиСенс Mycoplasma genitalium-FL»,  «АмплиСенс M. hominis/G. Vaginalis - МУЛЬТИПРАЙМ - FL», и «АмплиСенс C. trachomatis/M. hominis- МУЛЬТИПРАЙМ-FL». Поскольку «Терцик МС2» относится к аппаратам с регулированием температур по матрице, придерживались рекомендаций в отношении температурного и временного режима для аппаратов такого типа. Количество циклов составляло 42. По окончании реакций проводили детекцию амплифициованных фрагментов ДНК. Учитывая возможность получения ложноположительных результатов при анализе продуктов амплификации при помощи электрофореза в агарозном геле, в наших исследованиях использовали флуоресцентный анализатор «ALA-1/4», исключающий недостатки электрофорезного метода, приводящие к возможности получения ложноположительных результатов.

Эксперименты проводили в течение 7 месяцев с января по  июль 2011 г. Общее количество проведенных исследований составило 1662. Во всех экспериментах применяли три вида контролей:

• ОКО (отрицательный контрольный образец) для исключения ложноположительных результатов;
• ВКО (внутренний контрольный образец) для исключения ложноотрицательных результатов;
• ПКО (положительный контрольный образец) для выявления ДНК агентов.

Количество исследований на предмет выявления M. hominis и M. genitalium было приблизительно одинаковым: 803 и 859 образцов соответственно.

В качестве метода детекции продуктов амплификации был использован флуоресцентный анализ. На рисунке 2 представлен протокол одного из исследований.

M-G  - Mycoplasma hominis и Gargnerella vaginalis.

M. hom - Mycoplasma hominis.

M. gen - Mycoplasma genitalium.

Chlam- M. Gen - Chlamidia trachomatis и Mycoplasma genitalium.

При постановке реакции амплификации использовали тест-системы, позволяющие определить как один из видов возбудителей микоплазменной инфекции, так и одновременно две (дуплексные), включающие праймеры для выявления Mycoplasma hominis и Gargnerella vaginalis, а также Chlamidia trachomatis Mycoplasma genitalium. Так, в пробах 1 - 21 были использованы дуплексные тест-системы  «АмплиСенс C. trachomatis/M. genitalium - МУЛЬТИПРАЙМ-FL» и «АмплиСенс M. hominis/G. vaginalis - МУЛЬТИПРАЙМ-FL».

Так как ВКО  синтезированы во всех образцах, что видно из протокола, то все положительные результаты на наличие  M. hominis, обнаруженные у пациентов 9, 18 можно считать достоверными. Наличие M. genitalium ни в одном из представленных образцов не было выявлено.

В результате проведенных исследований 803 проб, проанализированных с целью определения ДНК M. hominis в 147 из них получен положительный результат, что составило 8,9 %. При изучении M. genitalium из 859 проб в 34 обнаружили искомую ДНК. Процент положительных образцов в этом случае составил 2%. Полученные результаты согласуются с литературными данными, свидетельствующими о том, что Mycoplasma genitalium распространены значительно реже, чем Mycoplasma hominis /3/.

В ряде случаев у пациентов определялся только один из представленных видов микоплазм. В пяти случаях у пациентов определялось наличие как M. hominis, так и M. genitalium.

По результатам  исследований составлена диаграмма, отражающая общее количество исследований по определению  M. hominis и M. genitalium, а также соотношения отрицательных и положительных результатов по каждому виду микоплазм (Рис. 3).

Из рисунка видно, что у исследуемых пациентов процент выявленных ДНК М. hominis составляет около 9, в том время, как M. genitalium - всего 2%. При этом количество анализов на наличие M. genitalium (51,6 %) незначительно превышает таковые на наличие М. hominis (48,4 %).

Таким образом, настоящее исследование выявило наибольшее распространение М. hominis среди пациентов, проживающих в Карагандинской области по сравнению с M. genitalium. Кроме того, выявлен больший процент положительных результатов у больных женского пола.

Дальнейшие исследования предполагают расширение спектра возбудителей микоплазменной инфекции.

Список использованных источников 

1. Ноников, В. Е., М. Г. Воробьева // Микоплазменные инфекции // Consilium medicum: журнал доказательной медицины для практикующих врачей / 2006. Том 8, № 10.
2. Борхениус С.Н. //Микоплазмы: молекулярная и клеточная биология, патогенность, диагностика// Л: «Наука» // 1989 г. - 156 с.
3. Кобахидзе М.Ш., Автушенко С.С., Гончарова С.А.  // Инфекция Mycoplasma hominis при некоторых воспалительных процессах мочеполового тракта человека  // Вестник АМН СССР / 1976. № 5. - С. 76-80.
4. http://www.venericheskie.com/diagnostika-mikoplazmoza.html
5. Бенькович А.С. // Инфекции, вызываемые Mycoplasma genitalium: клинические проявления, особенности диагностики и терапии // Клиническая дерматология и венерология // 2008. № 3. - С. 61-62.
6. Шипицына Е.В. // Mycoplasma genitalium как возбудитель инфекций урогенитального тракта: патогенез, клиника, диагностика и лечение // Журнал акушерства и женских болезней / 2008.  № 57 - С. 111-120.
7. Гущин А.Е., Бурцев O.A., Рыжих П.Г. // Мониторинг лечения пациентов с инфекцией, вызванной M. genitalium, с помощью методов ПЦР и НАСБА в реальном времени // Клиническая дерматология / 2009. №4. - С. 58-63.
8. Башмакова М.А., Савичева А.М. // Генитальные микоплазмы и микоплазменные инфекции // Трудный пациент / 2006. № 2.  - С. 24-30.

Код для цитирования: Скопировать