Николай Иванович родился в Москве в 1810 году, в семье военного казначея, майора Ивана Ивановича Пирогова (1772-1825), дома получил первоначальное образование, затем учился в частном пансионе Кряжева. Вступительный экзамен в университет выдержал 14 лет от роду (хотя прием в студенты лиц моложе 16 лет не разрешался) и зачислился на медицинский факультет.
В университете на него оказал большое влияние профессор М.Я. Мудров, своими советами изучать патологическую анатомию и заниматься производством вскрытий.
В 1833-1835 гг. находился в командировке в Германии, где совершенствовался по анатомии и хирургии у Б. Лангенбека.
Пирогов один из первых в Европе стал в широких размерах систематически экспериментировать, стремясь решать вопросы клинической хирургии опытами над животными. Известен метод Пирогова «Ледяной скульптуры»: он производил распилы в поперечном, продольном и переднезаднем направлении замороженных человеческих трупов. На основе данного метода исследования был создан атлас по топографической анатомии. Впервые в мировой практике предложил костнопластическую ампутацию стопы, что положило начало развитию костнопластической хирургии. Предложил ряд новых методов эфирного наркоза: внутривенного, эндотрахеального, прямокишечного. Н. И. Пирогов - основоположник учения о медицинской сортировке.
В 1855 год, во время Крымской войны, Пирогов был главным хирургом осажденного англо-французскими войсками Севастополя. Во время осады Севастополя руководил обучением и работой сестер «Крестовоздвиженской общины сестер милосердия».
В начале 1881 года Пирогов обратил внимание на боль и раздражение на слизистой твердого неба, и Н.В. Склифосовский установил наличие рака верхней челюсти. От этого недуга и умер Н.И. Пирогов в 20 ч 25 мин 23 ноября 1881 года.
Тело Пирогова было забальзамировано его лечащим врачом Д.И. Выводцевым с использованием нового метода, им разработанного, и погребено в мавзолее в деревне Вишня под Винницей.