III Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2011

В структуре смертности онкологические заболевания занимают 2 место, уступая лишь заболеваниям сердечно-сосудистой системы. Одной из наиболее актуальных проблем современной онкологии является рак желудка (РЖ), это обусловлено высокой частотой выявления заболевания и высоким удельным весом распространенности и запущенности. 

До сих пор не решена проблема ранней диагностики и рационального комбинированного лечения опухолевого процесса. Поэтому изучение  диагностической значимости частоты выявления изменений некоторых онкогенов и определение уровней экспрессии свободнорастворимых форм рецепторов эпидермального фактора роста EGFR и сосудистого эндотелиального фактора роста VEGFR в канцерогенезе РЖ у человека является весьма актуальной. Изучение молекулярно-генетической картины, а именно изменения в онкогенах р53 (5,6,7,8 ex), С-kit, B-raf, APC, K-ras, E-caderin, DPDY,  р16 и определение уровней экспрессии свободнорастворимых форм рецепторов EGFR и VEGFR   рассматривается в качестве одной из перспективных маркеров, характеризующих биологическое поведение опухоли, и позволяющие индивидуализировать подходы к назначению терапии больных РЖ. Но несмотря на значительное количество  исследований однозначного ответа на вопрос о значении изменений в онкогенах р53 (5,6,7,8 ex), С-kit, B-raf, APC, K-ras, E-caderin, DPDY,  р16 при развитии опухолевого процесса у человека до настоящего времени пока не получено.

Цель работы: изучить молекулярно-генетические изменения у больных с РЖ.

Задачи:

- Определить характер мутаций у больных РЖ в ДНК, выделенной из парафиновых образцов, плазмы и клеток крови; оценить их прогностическое значение.

- Определить уровень экспрессии свободнорастворимых форм рецепторов EGFR и VEGFR у больных РЖ; оценить их прогностическое значение.

    Материалы и методы: Объектом служили 47 больных РЖ, проходившие обследование и лечение в Тюменском областном онкологическом диспансере и «Центре молекулярно-генетической диагностики Сабирова А.Х.» за период времени с июля 2008 по сентябрь 2010гг, из которых в исследование были включены пациенты после оперативного лечения и с наиболее полной молекулярно-генетической картиной (n=11).

Определение уровня экспрессии свободнорастворимых форм рецепторов EGFR и VEGFR в сыворотке крови проводили с помощью метода иммуноферментного анализа (ИФА) в модификации ELISA. Материалом для молекулярно-генетического исследования послужили клетки опухоли, плазма и клетки крови больных. Выделение ДНК проводили с помощью метода фенол-хлороформной экстракции. Наличие мутаций определяли в онкогенах р53 (5,6,7,8 ex), С-kit, B-raf, APC, K-ras, E-caderin,  DPDY и р16 с использованием специально подобранных праймеров. Результаты анализов верифицировали прямым секвенированием полученных фрагментов ПЦР.

Результаты: 63,6% больных (7 чел.) была выполнена радикальная операция (дистальная субтотальная резекция желудка, проксимальная субтотальная резекция желудка, гастрэктомия), 27,3% (3чел.) были прооперированны паллиативно (гастрэктомия, дистальная субтотальная резекция желудка, гастростомия) и 9%(1 чел.) операций были выполнены с диагностической целью.

При молекулярно-генетическом исследовании, как в ДНК парафиновых образцов, так и в ДНК плазмы крови наибольшее количество мутаций определяется при низкодифференцированном варианте опухоли (n=7) в генах p53 (5,6,7,8 ex), C-kit, E-caderin, K-ras, АРС, p16 и сопровождается высоким индексом пролиферативной активности опухолевых клеток Ki-67=71,25%; при умереннодифференцированном варианте опухоли (n=2) мутации были выявленны в генах p53 7ex, B-raf, C-kit; несколько меньшее число мутаций выявлено при высокодифференцированном варианте опухоли (n=2) изменения в генах p53 (6,7ex), АРС. В ДНК, выделенной из клеток крови, подобные изменения не выявлены.

Самое большое количество мутаций приходится на ген p53 в 7ex, что может рассматриваться в качестве маркера агрессивности опухолевых клеток.

У радикально прооперированных больных молекулярно-генетические изменения, в ДНК выделенной из плазмы крови наблюдались в следующих онкогенах -  p53 5ex(n=1), p53 6ex(n=1), p53 7ex(n=4), p53 8ex(n=1), C-kit(n=3), E-caderin(n=2), АРС(n=1), B-raf(n=1), то есть не была констатирована молекулярная ремиссия, что не соответствует отнесению их в 3 клиническую группу, и что следует учитывать для выбора дальнейшей тактики проведения химиотерапии.

В 81,7% случаев (9 чел.) химиотерапия была назначена сразу же после оперативного лечения или после проведенного молекулярно-генетического исследования. В 18,2% случаев (2 чел.) химиотерапия не была назначена, а по результатам молекулярно-генетического  исследования наблюдались мутации некоторых онкогенов и гиперэкспрессия свободнорастворимых форм рецепторов EGFR и VEGFR.

При проведении молекулярно-генетического исследования и ИФА в модификации ELISA  после двух курсов химиотерапии достоверного снижения количества мутаций не было отмечено, что говорит о том, что молекулярная ремиссия не была достигнута и должна учитываться для выбора дальнейшей тактики проведения химиотерапии.

   При определении уровней экспрессии свободнорастворимых форм рецепторов EGFR в сыворотке крови у 11 больных РЖ среднее значение его уровня составило 4,38 ммоль/л, что превышает пороговое значение нормы EGFR - 3,6 ммоль/л, VEGFR 0,5 ммоль/л, что в два раза превышает нормальные значения VEGFR - 0,25 ммоль/л; что является показанием для назначения таргетной терапии.

Выводы: - Таким образом, наиболее частыми мутациями у больных РЖ в ДНК, выделенной из парафиновых образцов являются мутации генов Р53 (5,6,7ех), C-kit, АРС, что коррелирует с низкой дифференцировкой опухолевых клеток и сопровождается высоким индексом пролиферативной активности Ki-67=71,25%. При исследовании ДНК плазмы крови наиболее частые мутации встречаются в генах  Р53 (5,7ех), C-kit, E-caderin, что также коррелирует с низкой дифференцировкой опухолевых клеток и высоким индексом пролиферативной активности. Подобные изменения в ДНК клеток крови не определяются.

 - Средний уровень экспрессии свободнорастворимых форм рецепторов EGFR в сыворотке крови составил 4,38 ммоль/л, VEGFR 0,5 ммоль/л, что встречается при различных вариантах дифференцировки опухоли.

 

The diagnostic importance of molecular-genetic changes of patients with gastric cancer.

Muktubaeva A. J.

Science advisors: head of the department of oncology with course of radiological diagnostics and therapy, Doctor of Medicine, аssociate professor Shanazarov N. А.; аssociate professor of the department of oncology with course of radiological diagnostics and therapy, Doctor of Medicine Sabirov A.H.

Tyumen state medical academy

Department of oncology with course of radiological diagnostics and therapy, Tyumen, Russia.

 

In death rate structure oncological diseases occupy 2d place, conceding only to diseases of cardiovascular system. One of the most actual problems of up-to-day oncology is the Gastric Cancer (GC), it is caused by high frequency of revealing of disease and high relative density of prevalence and neglect.

The problem of early diagnostics and the rational combined treatment of tumoral process isn´t still solved . Therefore it´s rather actual to research the diagnostic importance of revealing some oncogeneses changes frequency  and to define the levels of an easily soluble forms  expression of epidermal growth factor receptor EGFR and Vascular endothelial growth factor receptor VEGFR in GC carcinogenesis of  people.

Researching of Molecular-genetic features, that is changes in oncogenes р53 (5,6,7,8 ex), С-kit, B-raf, APC, K-ras, E-caderin, DPDY, р16 and revealing the levels of easily soluble forms expression of EGFR and VEGFR is considered as markers characterizing biological tumor´s way of manifestation and help us to individualize approaches to therapy.

There is no an unambiguous answer on a question about the  value of human tumoral process development changes in oncogenes р53 (5,6,7,8 ex), С-kit, B-raf, APC, K-ras, E-caderin, DPDY, р16 in spite of significant amount of researches.

Purpose: To research molecular-genetic changes in patients with gastric cancer (GC).

Tasks: to define mutation character in patients with GC in DNA, isolated from paraffin specimens and blood plasma and expression level of freely soluble forms of epidermal growth factor´s receptors EGFR and vascular endothelial growth factor, to estimate their prognostic meaning.

Materials and methods: Object of research were 47 patients with gastric cancer, who undergo assessment and cure in Tyumen Region Oncological Clinic and were examined in "Center of molecular-genetic diagnostic Sabirova A. H." from July 2008 to September 2010, after underwent surgery 11 patients with the most full  Molecular-genetic features were included into researching (n=11).

Expression level of EGFR and VEGFR detection in blood plasma was made with IEA in modification ELISA. Tumor cells and blood plasma were materials. Extraction of DNA was conducted with phenol-chloroform method.

The existence of mutation in oncogenes р53 (5,6,7,8 ex), С-kit, B-raf, APC, K-ras, E-caderin,  DPDY и р16 were defined by using specially selected primers.

Analysis results were verified by direct sequencing of PCR fragments.

Results: 63,6 % patients (7 people) were undergone radical surgery (distal subtotal gastrectomy, a proximal subtotal gastrectomy, gastrectomy), 27,3 % patients (3 people) were operated nonradical (gastrectomy, distal subtotal gastrectomy, gastrostomy) and 9 % operations (1 people) have been executed with the diagnostic purpose.

The molecular-genetic research, both in DNA of paraffin samples, and in DNA of blood plasma shows the maximum amount of mutations was detected by low differentiation of tumor cells (n=7) in genes p53 (5,6,7,8 ex), C-kit, E-caderin, K-ras, APC, p16 and accompanied by high proliferative activity index Ki-67=71,25%; in moderate differentiation (n=2) mutations were detected in genes p53 7ex, B-raf, C-kit; not so much mutations were detected in high differentiation tumor variant (n=2) changes in genes p53 (6, 7ex), APC.  In DNA allocated from blood cells, similar changes won´t revealed.

The considerable quantity of mutations happens to be on a gene p53 in 7ex that can be considered as a marker of tumoral cells aggression.

Radically operated patients has molecular-genetic changes in DNA of the blood allocated from plasma were observed in following oncogenes - p53 5ex (n=1), p53 6ex (n=1), p53 7ex (n=4), p53 8ex (n=1), C-kit (n=3), E-caderin (n=2), АРС (n=1), B-raf (n=1), so molecular remission was not ascertained, that that doesn´t correspond to their reference at 3 clinical group and should be taken into consideration for selection of further chemotherapy tactic.

In 81,7 % of cases (9 people) the chemotherapy has been appointed at once after operative treatment or after the conducted molecular-genetic research. In 18,2 % of cases (2 people) the chemotherapy hasn´t been appointed, and by results of molecular-genetic research mutations of some oncogenes and a hyperexpression easily soluble forms  of receptors EGFR and VEGFR were observed.

After two courses of chemotherapy the molecular-genetic research and IEA in version ELISA doesn´t reveal the authentic decrease of mutations sot molecular remission has not been reached and should be considered for a choice of further tactics of chemotherapy.

Evaluation expression levels of easily soluble forms  of receptors EGFR in blood plazma of 11 GC patients found out that average measures of EGFR level was 4,38 mmol/l, that is higher then threshold value EGFR-3,6 mmol/l, VEGFR=0,5 mmol/l, that is twice as bigger as normal VEGFR level - 0,25 mmol/l; which is indication for prescribing target therapy.

Resume: - Now therefore gastric cancer patients DNA, extracted from paraffin samples, most frequent mutations were detected in genes p53 (5,6,7, ex), C-kit, APC,  that correlates with low differentiation of tumor cells and high index of proliferative activity Ki-67=71,25%. The DNA research of blood plazma , most frequent mutations were detected in genes p53 (5,7 ex), C-kit, E-caderin, that also correlates with low differentiation of tumor cells and high index of proliferative activity. Such changes in DNA of blood cells can´t be defined.

• - Average measures easily soluble forms of receptors EGFR expression in blood plazma was 4,38 mmol/l, VEGFR 0,5 mmol/l, that is common in different variants of tumor differentiation.

Код для цитирования: Скопировать