III Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2011

Ферментативные реакции, лежащие в основе биосенсорного анализа, чаще всего подчиняются общим законам катализа, но вследствие сложности состава и строения клеток, являются  многостадийными процессами. На процесс протекания ферментативных реакций влияют разные факторы, такие как: ингибирование и активация субстратом, рН среды, температура, процессы диффузии через клеточную мембрану и т.п.

Каталитическое поведение микроорганизмов, как  биорецепторного элемента микробного сенсора, можно представить в виде модели, в которой ферментные системы находятся за мембраной клетки. В этом случае необходимо учитывать диффузию субстрата к активным центрам ферментов наряду с ферментативной реакцией.

Для нахождения кинетических параметров ферментативных реакций используют разнообразные методы. Основным методом является анализ начальных скоростей по уравнению Михаэлиса - Ментен:

Оно иллю­стрирует гиперболическую зависимость скорости ферментативной реакции от начальной концентрации субстрата и линейную зави­симость - от концентрации фермента. К_m(каж) - равна концентрации субстрата при скорости ферментативной реакции, равной половине максимальной скорости и  характеризует сродство данного фермента к тому или иному субстрату.

 Данное уравнение справедливо для следующей схемы процесса:

в которой Е - фермент; S  - субстрат; K_s- константа диссоциа­ции фермент-субстратного комплекса.

Исследования в работе проводились на биосенсорной установке  показанной на рисунке 1. В качестве преобразователя для измерения содержания молекулярного кислорода использовали потенциостат IPC 2L с электродом Кларка (рабочий потенциал -700 мВ). Между полупроницаемой мембраной электрода и защитным колпачком помещался рецепторный элемент с иммобилизованными клетками Gluconobacter оxydans. Иммобилизацию клеток проводили в пленку на основе поливинилового спирта (ПВС), модифицированного N-винилпирролидоном.

Рисунок 1. Принципиальная схема биосенсорной установки

1 - штатив, 2 - кислородный электрод Кларка с биорецепторным элементом,

3 - измерительная кювета, 4 - магнитная мешалка, 5 - потенциостат IPC 2L, 6 - ЭВМ

В работе построены зависимости ответов сенсора от концентрации двух субстратов: глюкозы и этанола. Из данных зависимостей найдены кинетические параметры ферментативных реакций, такие как кажущаяся константа Михаэлиса и максимальная скорость ферментативной реакции.

Таблица 1. Кинетические параметры ферментативных реакций, протекающих в биорецепторном элементе

Выявление скоростьопределяющей стадии проводили по методике описанной в книге Э.Тёрнера «Биосенсоры: основы и приложения». Для определения лимитирующей стадии вводятся параметры r и y, которые не имеют конкретного физического смысла, но позволяют представить экспериментальные данные в необходимом для анализа виде.

Скорость процессов, протекающих в биосенсоре, лимитирует диффузия субстрата через мембрану к активным центрам ферментов, если отрезок, отсекаемый прямой на оси абсцисс равен значению близкому к единице. Если зависимость у от  носит характер прямой, практически параллельной оси абсцисс то, следовательно, скорость процессов, протекающих в биосенсоре лимитируют ферментативные процессы.

Из полученных в работе данных можно сделать следующий вывод: в области низких концентраций (от 0,0150 до 0,2000 ммоль/дм³)  лимитирующей стадией процесса, для биосенсора на основе  иммобилизованных клеток G.оxydans в пленку на основе ПВС, модифицированного N-винилпирролидоном, является диффузия субстрата через мембрану. В области более высоких концентраций (от 0,2500 до 8,2500 ммоль/дм³) лимитирующей стадией процесса является ферментативная реакция.