III Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2011

Одним из наиболее распространенных загрязнителей в современном мире является нефть и нефтепродукты. Для определения широкого спектра органических соединений, в том числе - ароматических углеводородов и их производных, в образцах окружающей среды могут быть использованы микробные биосенсоры. Биосенсоры полезны при непрерывном мониторинге загрязненной области. Главное преимущество биосенсоров заключается в том, что их использование позволяет проводить анализ  образцов без пробоподготовки в полевых условиях. Хотя многие биосенсорные методы не могут конкурировать с обычными аналитическими методами по точности и воспроизводимости определения, они могут использоваться как экспресс-методы для рутинного анализа. Кроме того, исследование биохимического поведения микроорганизмов в условиях  электрокаталитического окисления субстратов может внести вклад в понимание механизмов функционирования ферментных систем бактериальных клеток.

Среди грамотрицательных бактерий наиболее эффективные деструкторы ксенобиотиков относятся к роду псевдомонад. Бактериальный штамм Pseudomonas putida BS3701 способен к биодеградации углеводородов. Однако возможность биоэлектрокаталитического окисления органических соединений этими бактериями в присутствии медиаторов электронного транспорта не изучена. Целью данной работы являлось изучение функционирования ферментных систем бактерий Pseudomonas putida BS3701 при электрокаталитическом окислении субстратов в присутствии различных медиаторов электронного транспорта в рецепторном элементе биосенсора. В качестве медиаторов использовали ферроцен и 1,1´-диметилферроцен.

В работе использовали углеродно-пастовый электрод с иммобилизованными адсорбцией бактериями  Pseudomonas putida BS3701. Медиаторы вводили в состав углеродной пасты. Измерения проводили в амперометрическом режиме при потенциале 250 мВ в фосфатно-цитратном буферном растворе рН=6,0 при постоянном перемешивании.

Была изучена субстратная специфичность бактерий Pseudomonas putida BS3701 в условиях электрокаталитического окисления. В качестве субстратов использованы компоненты нефти и итермедиаты биодеградации углеводородов нефти - гексан, октан, толуол, нафталин, бензойная кислота, салициловая кислота, и глюкоза- универсальный источник углерода и энергии практически для всех микроорганизмов. Сенсоры на основе бактерий Pseudomonas putida BS3701 в присутствии медиаторов ферроцена и 1,1´-диметилферроцена генерировали ответы только на один из исследуемых субстратов - глюкозу. Следовательно, система «бактериальные клетки Pseudomonas putida BS3701 - медиатор» не может использоваться для определения компонентов нефти и интермедиатов ее биодеградации.

Для сравнительной оценки эффективности взаимодействия медиаторов электронного транспорта с ферментами в составе целых клеток в качестве субстрата использовали глюкозу. Окисление глюкозы иммобилизованными бактериями в присутствии медиаторов переноса электронов рассматривали как двухсубстратную ферментативную реакцию, протекающую по механизму «пинг-понг». Из принятой  модели следует, что отношение величин I_max/K_M характеризует взаимодействие медиатора с активным центром фермента и дает индекс эффективности медиатора. Из полученных для биосенсоров на основе бактерий Pseudomonas putida BS3701 зависимостей генерируемого тока I от концентрации глюкозы в условиях избытка медиатора  и от концентрации медиаторов при избытке глюкозы (50 мМ) были вычислены значения максимального тока биоэлектрокаталитического окисления I_max и константы Михаэлиса по субстрату K_S и медиатору K_м. Анализ величин I_max/K_M для показал, что в исследуемой системе 1,1´-диметилферроцен является более эффективным медиатором электронного транспорта, чем ферроцен. Таким образом, параметром, оказывающим существенное влияние на скорость электрокаталитического процесса, является тип используемого медиатора.

Полученные данные имеют практическую значимость и могут использоваться при создании медиаторных биосенсоров.

Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (2009-2013 г.) госконтракт №02.740.11.0296, госконтракт №П258