III Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2011

С появлением высокоиндустриального общества большую опасность представляет собой загрязнение окружающей среды нефтью и нефтепродуктами. Перспективным способом очистки нефтезагрязненных территорий является биоремедиация, осуществляемая внесением бактерий-нефтедеструкторов.

Наибольшую угрозу для жизнедеятельности биоты представляют полиароматические углеводороды, являющиеся канцерогенами и способными вызывать мутационные изменения. Бактерии рода Pseudomonas способны к деградации различных полиароматических соединений, но биоокисление некоторых субстратов идёт эффективно только за счёт ферментов, кодируемых катаболическими плазмидами, в том числе плазмидами биодеградации нафталина.

В работе использовали бактериальный штамм Pseudomonas aureofaciens BS1393, модифицированный плазмидами биодеградации нафталина pBS216 и pOV17. P. aureofaciens BS1393 относится к группе бактерий, стимулирующих рост растений, плазмиды pBS216 и pOV17 обеспечивают окисление не только нафталина, продуктов его окислительного превращения, но и ряда производных за счет широкой субстратной специфичности кодируемых плазмидами оксигеназ. Совмещение в нефтедеструкторах биодеградативных и фитостимулирующих функций является актуальным направлением. Для успешного использования плазмидосодержащих микроорганизмов необходимо изучение их катаболических путей и закономерностей функционирования ферментов биодеградации, в том числе оксигеназ.

Целью работы явилась оценка активностей ферментных систем окисления ароматических соединений нефтедеструкторов P. aureofaciens BS1393(pBS216) и P. aureofaciens BS1393(pOV17) двумя способами: спектрофотометрическим и с помощью микробного биосенсора на основе кислородного электрода.

Плазмиды биодеградации pBS216 и pOV17 являются структурно аналогичными, но, перенесенные в бактериальный штамм P. aureofaciens BS1393, приводят к появлению отличающихся культуральных характеристик у трансконьюгантов при росте в парах нафталина на твердой агаризованной среде Эванса. Так, P. aureofaciens 1393(pBS216) вызывает более интенсивную пигментацию культуральной среды вследствие накопления промежуточных продуктов окисления нафталина, что может быть связано с разной активностью ферментных систем трансконьюгантов.

Активности ферментов биодеградации нафталина (нафталин-1,2-диоксигеназы и салицилатгидроксилазы) определяли спектрофотометрически по уменьшению экстинкции НАДН в бесклеточных бактериальных экстрактах. Активности нафталин-1,2-диоксигеназы и салицилатгидроксилазы оказались выше у P. aureofaciens 1393(pBS216) (на 27% и 22% соответственно), что косвенно подтверждается более высокой пигментацией культуральной среды у данного штамма.

Необходимо отметить, что получение бесклеточных экстрактов и спектрофотометрическое определение активностей ферментов представляет собой длительный эксперимент, требует дорогостоящих реактивов, бактериальные лизаты быстро теряют активность. Так, активность салицилатгидроксилазы на второй день (хранение при

-4ºС) уменьшается в 2 раза. Микробное окисление ароматических нефтекомпонентов непосредственно связано с потреблением кислорода, что дает возможность использовать биосенсоры амперометрического типа на основе кислородного электрода для оценки окислительной активности. Биосенсорный анализ отличается экспрессностью измерений и пробоподготовки: единичное измерение занимает 15мин, подготовка биорецепторного элемента - 15-50мин (в зависимости от способа иммобилизации бактерий).

Биосенсорная оценка микробной окислительной активности в отношении ароматических соединений показала, что профили субстратной специфичности штаммов сходны, но у штамма с плазмидой pBS216 более высокая скорость и объем потребления кислорода. Так, скорость окисления салицилата у штаммов с разными плазмидами отличается в 2 раза, нафталина - в 3,3 раза. Величины активностей нафталин-1,2-диоксигеназы и салицилатгидроксилазы, полученные спектрофотометрическим методом, хорошо согласуются с биосенсорными данными. Коэффициент корреляции величин, полученных двумя способами, равен 0,97.