III Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2011

Важной аналитической характеристикой биосенсора является субстратная специфичность. Обычно субстратную специфичность представляют в виде диаграммы, на которой приводят ответы биосенсоров при определенной концентрации исследуемых субстратов. Однако такой подход не всегда может корректно отражать сродство исследуемого биоматериала к субстрату, так как соотношение токов биоэлектрокаталитического окисления различных субстратов в зависимости от концентрации может изменяться. В ряде случаев эффективность взаимодействия биоматериала с субстратом характеризуют кажущейся константой Михаэлиса, которая в случае медиаторного биоэлектрокатализа отражает взаимодействие ферментных систем клеток не только с субстратом, но и с медиатором.

Таким образом, необходимо выявить параметр, характеризующий эффективность взаимодействия ферментативных систем бактерий с субстратами в рецепторном элементе биосенсора.

В качестве модельной системы в работе использован медиаторный биосенсор на основе бактерий Gluconobacter oxydans и ферроцена. Известно, что бактерии Gluconobacter oxydans содержат PQQ-зависимые мембранлокализованные альдоз- и алкогольдегидрогеназы, способные окислять целый ряд углеводов и спиртов. Исходя из этого, в  качестве модельных субстратов были выбраны одноатомные спирты с разветвленным и неразветвленным углеродным скелетом и длиной цепи от 1 до 4 атомов углерода и глюкоза.

Таким образом, цель работы состояла в выявлении кинетического параметра, характеризующего взаимодействие ферментных систем биокатализатора с субстратом, и применении этого параметра для оценки субстратной специфичности бактерий Gluconobacter oxydans в процессе биоэлектрокаталитического окисления спиртов и глюкозы.

1. Материалы и методы

1.1. Культивирование бактерий  Gluconobacter oxydans

В работе были использованы бактерии Gluconobacter oxydans (Всероссийская коллекция микроорганизмов, ИБФМ РАН). Культивирование бактерий проводили на колбах объемом 500 мл на питательной среде следующего состава:

1. D-сорбит - 200 г/л;

2. Дрожжевой экстракт - 20 г/л;

3. Дистиллированная вода - 100 мл;

 pH среды - 5,2-5,5, при температуре 28оС, в течение 18-20 часов. После культивирования клетки собирали центрифугированием при 8 000 об/мин 15 мин и отмывали двукратно фосфатно-цитратным буфером с добавлением Ca2+ рН 6,0. Осевшие клетки ресуспендировали в новой порции буфера и центрифугировали 5 мин. Полученные осадки в пробирках «Эпендорф» подсушивали на воздухе в течение часа, и замораживали для длительного хранения при температуре -15^оС. Вес всех порций биомассы регистрировали. Для каждой серии опытов использовали новые клетки, размороженные в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем  разбавленные фосфатно-цитратным буфером с добавлением Ca2+ рН 6,0 до концентрации 200 мг/мл. Среду для выращивания бактериальных клеток Gluconobacter oxydans приготавливали в колбах и стерилизовали автоклавированием при 1 атмосфере в течение 45 мин.

3.2. Формирование электрода

Микробные биосенсоры формировали, наполняя приготовленной пастой «графитовая пудра-минеральное масло» пластиковую трубку. Пластиковая трубка содержала серебряную проволоку для электрического контакта с частицами графита.

Электроды на основе иммобилизованных медиаторов формировали следующим образом: 100 мг графитовой пудры смешивали с необходимым (для получения требуемой концентрации медиатора в графитовой пасте) количеством 1% раствора медиатора в ацетоне, после испарения ацетона добавляли 40 мкл парафинового масла и замешивали пасту.  Такой модифицированной пастой заполняли пластиковую трубку.

Клетки микроорганизмов Gluconobacter oxydans иммобилизовали следующим образом: на поверхность пасты, заполняющей шприц, наносили 5 мкл суспензии клеток Gluconobacter oxydans 200 мг «сырого» веса/мл, и подсушивали при комнатной температуре в течение 15 мин. Для прочной иммобилизации клеток  на поверхности электрода при помощи пластикового кольца закрепляли диализную мембрану.

3.3. Методика электрохимических измерений

Регистрацию ответов биосенсоров проводили по двухэлектродной схеме. Рабочим электродом служил угольно-пастовый электрод (площадь поверхности 6,3 мм²) с иммобилизованными клетками микроорганизмов Gluconobacter oxydans, электродом сравнения - насыщенный хлорид-серебряный. Измерения проводили в цитратно-фосфатном буфере с рН 6,0 с добавлением ионов Са²⁺ при постоянном потенциале ферроцена 300 мВ при комнатной температуре и давлении; объем ячейки - 4 мл. Измерения производились при непрерывном перемешивании раствора, находящегося в электролитической ячейке, при помощи магнитной мешалки. После установления постоянного уровня тока в ячейку микропипеткой вводили необходимое для получения заданной концентрации количество 1 М раствора субстрата. После каждого измерения производили промывку ячейки цитратно-фосфатным буфером до установления постоянного значения тока (3 раза  по 4 мл).

Измеряемым параметром сигнала сенсора являлась амплитуда изменения силы тока, определяемая как разность  между начальным и конечным значениями токов до и после введения субстрата в измерительную кювету.

2. Результаты и обсуждение

Рассмотрим процессы, протекающие в рецепторном элементе микробного медиаторного биосенсора. В работе исследовали биоэлектрокаталитическое окисление спиртов различного строения и глюкозы бактериями Gluconobacter oxydans в присутствии медиатора переноса электронов - ферроцена. Окисление спиртов в бактериях  Gluconobacter oxydans катализирует мембраносвязанная алкогольдегидрогеназа, улеводов - мембраносвязанная глюкоздегидрогеназа.

Взаимодействие в системе «ферментные системы бактерий - субстрат - медиатор» можно рассматривать как двухсубстратную реакцию, которая протекает по механизму «пинг-понг», когда последовательные стадии взаимодействия субстратов S и M_oк с активным центром фермента разделены необратимым химическим превращением [1], что можно описать следующей схемой:

Из уравнения (5) следует, что процесс электрокаталитического окисления субстратов бактериальными клетками в присутствии медиаторов переноса электронов можно охарактеризовать тремя параметрами - максимальным током биоэлектрокаталитического окисления I_max, и константами Михаэлиса по субстрату K_S и медиатору K_M.

Из уравнений 11 и 12 следует, что в выражения и для I_max, и для K_S входят константы скорости стадий взаимодействия ферментных систем не только с субстратом (k₁, k_-1, k₂), но и с медиатором (k₄).

Отношение I_max/K_S содержит только, константы скорости стадий взаимодействия ферментных систем с субстратом (k₁, k_-1, k₂) и характеризует эффективность этого взаимодействия.

Таким образом, параметр I_max /K_S отражает сродство ферментных систем клеток к субстрату и может использоваться при изучении субстратной специфичности биоматериала.

Экспериментально были получены ответы медиаторных биосенсоров на основе бактерий  Gluconobacter oxydans на максимальные концентрации спиртов различного строения и глюкозы. Данные представлены на диаграмме рис. 1.

Из рис. 1. следует, что токи электрокаталитического окисления спиртов возрастают в ряду:

1,1-диметилэтанол< глицерин < пропанол-2< глюкоза < 2-метилпропанол-2 ~ бутанол-1~этанол < пропанол-1.

Для 2-метиллпропанол-2, этанола, бутанола-1 и пропанола-1 были получены зависимости (рис.2) токов биоэлектрокаталитического окисления от концентрации субстратов в условиях избытка медиатора (ферроцена). Для пропанола-2, глицерина, 1,1-диметилэтанола аналогичных зависимостей не получили, т.к. величины токов, генерируемых в присутствии перечисленных субстратов, очень малы.

Путем обработки полученных экспериментально зависимостей генерируемого тока I при варьировании концентрации глюкозы в условиях избытка медиатора по уравнению (33) были вычислены значения I_max, K_S и I_max/K_S, представленные в таблице 1.

Таблица 1. Кинетические параметры биоэлектрокаталитического окисления субстратов бактериями Gluconobacter oxydans.

Субстрат	Кs, ммоль/л	I max нА	Imax/KS, нА/ммоль
Этанол	7,0 ± 0,3	1300 ± 20	190 ± 10
Пропанол-1	4,0 ± 0,3	1460 ± 20	360 ± 10
Бутанол-1	4,3 ± 0,2	1280 ± 20	300 ± 20
2-метиллпропанол-2	9,1 ± 0,7	1210 ± 30	130 ± 10
глюкоза	3,9 ± 0,3	1060 ± 20	320 ± 20

Из анализа значений I_max/K_S можно заключить, что эффективность взаимодействия субстратов с ферментными системами бактерий Gluconobacter oxydans возрастает в ряду:

2-метиллпропанол-2< этанол< бутанол-1 ~ глюкоза <  пропанол-1

Отношение I_max/K_S содержит только, константы скорости стадий взаимодействия ферментных систем с субстратом (k₁, k_-1, k₂), характеризует взаимодействие фермента с субстратом и не зависит от типа медиатора.

Анализ величин максимальных токов I_max, дает другой ряд:

глюкоза < 2-метиллпропанол-2 ~ бутанол-1~этанол < пропанол-1.

Изменение положения глюкозы в данном ряду связано с тем, что в значение I_max значительный вклад вносит не только константа скорости k₂, но и константа скорости k₄, которая характеризует взаимодействие ферментных систем с медиатором. Величины констант k₄ в случае окисления глюкозы и спиртов будут отличаться, так как превращение данных субстратов катализируется различными ферментами - глюкоздегидрогеназой и алкогольдегидрогеназой соответственно.

Изменение положения этанола объясняется значительным вкладом в значение I_max/K_S  констант скорости k₂, которые отличаются для спиртов различного строения.

Таким образом, для оценки сродства биокатализатора к субстрату в микробных медиаторных биосенсорах необходимо использовать величину I_max/K_S, а не I_max, так как на последнюю величину оказывает влияние взаимодействие фермента с медиатором.

Выводы

1. Для характеристики эффективности взаимодействия субстратов с ферментными системами бактерий в случае медиаторного электрокатализа необходимо использовать параметр I_max/K_S, который не зависит от природы медиатора и характеризует взаимодействие фермента с субстратом.

2. Из анализа значений I_max/K_S установлено, что эффективность взаимодействия субстратов с ферментными системами бактерий Gluconobacter oxydans возрастает в ряду: 2-метиллпропанол-2< этанол< бутанол-1 ~ глюкоза <  пропанол-1

Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (2009-2013 г.) госконтракт №02.740.11.0296, госконтракт №П258

Код для цитирования: Скопировать