III Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2011

Повышение продуктивности сельскохозяйственных растений и их устойчивости к различным биотическим и абиотическим стрессовым факторам внешней среды является важнейшей проблемой современной агробиотехнологии. Одним из путей решения этой задачи является разработка биотехнологических основ защиты растений от фитопатогенов с помощью их колонизации ассоциативными микроорганизмами.

Существует еще один метод защиты растений от патогенов - перенос генов антибактериальных пептидов. Антимикробные пептиды являются интегральной частью неспецифической иммунной системы всех многоклеточных организмов и обладают широким спектром бактерицидной и фунгицидной активности.

Объектом исследования были растения табака сорта «Самсун», выращенные в культуре in vitro и в дальнейшем трансформированные штаммом Agrobacterium tumefaciens GV3101(pMP90RK, pGA482::cecP1).

Важной задачей после получения трансгенных растений является проверка их на наличие целевого гена. Присутствие гена цекропина Р1 в геноме исследуемых растений было подтверждено методом ПЦР-анализа ДНК с праймерами к целевому гену cec P1. Размер, образующихся в результате амплификации фрагментов ДНК - 104 пар нуклеотидов - соответствовал полному размеру гена цекропина Р1.

Одной из задач нашего исследования было исследовать возможность колонизации трансгенных растений ассоциативными микроорганизмами. Для колонизации растений использовали штамм Pseudomonas aureofaciens с геном  красного флуоресцентного белка RFP. Через 2 недели после колонизации проводили тестирование различных эксплантов (корни, листья) на установление ассоциативной связи с бактериями. Микробиологический анализ проводили путем нанесения экстрактов на поверхность питательной среды LB в чашках Петри. Характерный оранжевый цвет колоний обусловлен синтезом феназинов псевдомонадами.  Микроскопирование растительных образцов на флуоресцентном микроскопе доказало наличие бактериальных клеток как в срезе листа, так и в срезе корня. На срезе листа были видны яркие флуоресцирующие бактерии. Фон поверхности самих листьев был темно-красный, за счет свечения хлорофилла. Корни хлорофилла не имеют, поэтому красный цвет корней обусловлен только многочисленным присутствием псевдомонад, содержащих ген флуресцентного белка rfp . Количество бактерий в корнях было значительно больше по сравнению с листьями, что подтверждает ризогенную природу бактерий.

Таким образом, трансгенные растения способны колонизироваться полезными ассоциативными бактериями - псевдомонадами, так же как и контрольные, нетрансгенные. Это связано с местом  локализации бактерий - под кутикулой, в устьицах, в межклетниках. Они не разрушают клеточную стенку растений (в отличие от фитопатогенов) и не подвергаются воздействию антибиотического пептида цекропина, находящегося внутри клетки.

Колонизированные растения проверяли на устойчивость к фитопатогенным микроорганизмам E. Carotovora. Инфицирование растений E. carotovora показало, что уже через сутки на контрольных листьях отмечались признаки разрушения ткани мезофилла. К концу вторых суток  степень поражения контрольных листьев составила уже 100%. Листья колонизированных растений на данный момент остались без признаков повреждения

Процессы взаимодействий между микроорганизмами и растениями определяют существенные стороны физиологической активности последних. колонизированные растения имеют более развитую корневую систему, значительно превышают в росте и количестве листьев контрольные неколонизированные растения.

     В результате проведения работы были получены растения табака, устойчивые к фитопатогенам. Показана повышенная  устойчивость трансгенных  растений к фитопатогенным микроорганизмам. Колонизация растений ассоциативным штаммом Pseudomonas aureofaciens BS1393 приводила к стимуляции роста растений и повышению устойчивости к фитопатогенам. Полученные результаты указывают на перспективность применения генно-инженерных и микробиологических стратегий для повышения устойчивости растений к биотическим и абиотическим стрессовым факторам. Кроме того, использованные методы защиты растений от фитопатогенов являются экологически безопасными по сравнению с химическими методами и могут широко использоваться в сельском хозяйстве.